Журнал «Здоровье ребенка» 5(20) 2009

Введение

Недавно была выделена новая молекулярная группа, представители которой получили название «смерть-ассоциированные молекулярные структуры» (damage-associated molecular pattern proteins — DAMP) [19, 45, 54]. DAMP несут сигнал о смерти клетки. При высвобождении из внутриклеточного пространства DAMP проявляют высокую провоспалительную или даже повреждающую активность [4]. К данной молекулярной группе были отнесены и протеины семейства S100 [19].

Калпротектин (КП) семейства S100 протеинов впервые был обнаружен в 1983 году I. Dale и соавт. [14] в цитоплазме гранулоцитов как протеин, обладающий противомикробным действием. При инфекционно-воспалительных заболеваниях легких наблюдается быстрое увеличение концентрации КП. У здоровых людей в сыворотке крови концентрация КП составляет < 2 мг/л, а при развитии заболеваний ее уровень повышается в 40–130 раз. Увеличение содержания КП в бронхоальвеолярной жидкости прямо пропорционально местной нейтрофильной реакции [13, 26, 47, 58, 61]. Хронические воспалительные заболевания легких, муковисцидоз также сопровождаются высоким содержанием КП в бронхоальвеолярной жидкости [16, 53]. Показано, что и аллергическое воспаление респираторного тракта сопровождается усилением экспрессии КП [27, 49].

Краткая характеристика калпротектина

Семейство S100 объединяет 20 кальцийсвязывающих протеинов, молекулы которых характеризуются наличием 2 кальцийсвязывающих EF-мотивов (рис. 1). Первые S100 протеины были выделены из ткани головного мозга коровы в 1965 году. Концентрация данных белков в ткани мозга в 100 000 раз превышает их содержание в других тканях. Данная группа белков получила название S100 из-за их способности полностью растворятся в 100% растворе сульфата аммония при pH 7,2. В настоящее время показано, что три представителя семейства S100 — протеины S100A8, S100A9, S100A12, обнаруженные в гранулоцитах, моноцитах, макрофагах (на ранних стадиях их дифференцировки) участвуют в неспецифической противоинфекционной защите организма [19, 21, 64].

КП представляет собой кальций-, цинксвязывающий протеин, который состоит из двух полипептидных цепей — тяжелой цепи (14 kDa — S100A9/L1H/миелоидно-связанный белок MRP14/калгранулин B) и легкой цепи (8 kDa — S100A8/L1L/MRP8/калгранулин A/CF антиген) (рис. 2) [11, 24, 40, 65, 74]. Для молекулы КП характерны богатые гистидином цинксвязывающие области, аффинитет которых к цинку выше, чем у любых других белков семейства S100 [9, 23, 26].

Синтез протеинов S100A8 и S100A9 осуществляется различными генами, которые расположены на хромосоме 1 (1q12–q21) [62].

Особи мышей с нокаутным геном S100A8 погибают в эмбриональном периоде жизни, а мыши с нокаутным геном S100A9 не отличаются от здоровых особей [1, 35].

Индукция синтеза калпротектина

В респираторном тракте КП продуцируется эпителиоцитами, нейтрофилами, альвеолярными макрофагами, моноцитами, макрофагами или высвобождается при гибели клетки [61]. Индукция синтеза КП в респираторном тракте связана с возбуждением Toll-подобных рецепторов-2, -4 (TLR2, TLR4) патоген-ассоциированными молекулярными структурами инфекционных агентов и/или специфических рецепторов некоторыми цитокинами (TNF-α, IFN-γ и IL-1) [5, 69, 72]. Также представлены данные, что индукция экспрессии КП моноцитами может быть обусловлена любыми раздражителями, которые приводят к активации синтеза адреналина [43].

При изучении экспрессии 30 000 генов эпителиоцитов слизистой оболочки бронхов после их экспозиции с Pseudomonas aeruginosa было показано, что транскрипционный ответ исследуемой совокупности генов эпителиоцитов характеризуется выраженным повышением акивности генов 8 представителей семейства S100, особенно S100A8 и S100A9 [70].

КП составляет от 30 до 60 % цитозольного белка неактивных нейтрофилов и 1 % — моноцитов [15]. КП содержится в первичных гранулах нейтрофилов вместе с эластазой и катепсином G, во вторичных гранулах нейтрофилов вместе с лактоферрином и гранулами желатиназы (третичные гранулы) и представлен на мембране моноцитов. После стимуляции нейтрофилов цитоплазматически расположенные молекулы КП перемещаются к клеточной мембране и ассоциируются с ней. Данная ассоциация зависит от внутриклеточной концентрации ионов Ca2+ [62]. Секреция КП является энергозависимым процессом, который сопровождается активацией протеинкиназы С и метаболизма сети микроканальцев клетки. Субъединицы КП секретируются клетками альтернативным тубулинзависимым механизмом, не связанным с аппаратом Гольджи [36].

Индуцибельная продукция КП отмечается уже в первые 4 часа после стимулирующего действия липополисахаридов (ЛПС) или провоспалительных цитокинов [6, 31]. Показано, что через 12 часов после введения ЛПС в эпителиоцитах эпителия бронхиального дерева увеличивается в 2,9 раза экспрессия мРНК S100A8 и в 1,8 раза — мРНК S100A8 [71].

Продукция КП сопряжена с продукцией TNF-α, IL-6 и с генерацией активных радикалов кислорода, азота [61].

Механизм действия калпротектина

Противоинфекционное действие калпротектина

КП обладает бактериостатическим, противовирусным и фунгицидным действием (рис. 3). Антибактериальная эффективность действия КП сопоставима с активностью антибактериальных лекарственных средств [3, 39]. Считают, что бактериостатическое и фунгицидное действие КП обусловлено его способностью связывать ионы цинка, тем самым ограничивая потребление цинка микроорганизмами [12]. КП ингибирует рост грамположительных и грам­отрицательных бактерий (в концентрации 50–250 мг/мл), таких как Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, грибов — Candida albicans (в концентрации 4–32 мг/мл) [42, 74]. По мнению S. Yui и соавт. [74], КП является основным естественным молекулярным противогрибковым фактором в противоинфекционной защите. В своих исследованиях данные авторы показали, что сочетанное действие КП и лактоферрина превосходит фунгицидный эффект каждого отдельно действующего компонента. Локально в месте воспаления тканей наблюдается и гиперэкспрессия протеина S100A12, который также обладает выраженной антибактериальной активностью [8, 18].

Провоспалительное действие калпротектина

КП является ранним маркером воспалительного процесса. Показано, что содержание нейтрофилов в бронхоальвеолярном секрете коррелирует с количеством кальпротектин-положительных макрофагов, а уровень КП является маркером макрофагально-нейтрофильной реакции [32, 66].

Действие внутриклеточно расположенного калпротектина

После воздействия стимулирующего фактора цитоплазматически расположенные субъединицы КП S100A8 и S100A9 перемещаются к внутренней поверхности цитоплазматической мембраны клетки и микрофиламентам цитоскелета. Приблизившись к микрофиламентам, протеины S100A8 и S100A9 связываются с виментином — белком промежуточных микрофиламентов III типа цитоскелета клетки. По достижении определенного содержания цитоплазматически локализованных протеинов S100A8, S100A9 и уровня внутриклеточной концентрации ионов Ca2+ инициируется димеризация молекул S100A8, S100A9, обусловливая организацию гетеродимера КП и гетеротетрамеров S100 протеинов. Гетеротетрамеры (2 S100A8/S100A9) связываются с микроканальцами клетки, препятствуя полимеризации нитей тубулина. Считают, что влияние КП на активность полимеризации нитей тубулина является одним из молекулярных компонентов, которые обеспечивают способность моноцитов и гранулоцитов очень быстро перестраивать свой цитоскелет. Высокая скорость перестройки цитоскелета — необходимое качество фагоцитирующей клетки. Данное действие гетеротетрамеров (2 S100A8/S100A9) в фагоцитирующих клетках облегчает процесс фагоцитоза, а в эпителиоцитах приводит к цитоскелетной перестройке клетки. Снижение активности возбуждения фагоцитов сопровождается уменьшением внутриклеточной концентрации ионов Ca2+, которые необходимы для димеризации протеинов S100A8, S100A9. Ингибиция процесса димеризации ведет к увеличению концентрации мономерных протеинов S100A8, S100A9. В свою очередь, мономер S100A9 фосфорилирует p38 митогенактивируемую протенкиназу, которая ингибирует S100A8/S100A9-индуцируемую полимеризацию тубулина. В нейтрофилах гетеродимер (S100A8/S100A9) КП связывается и с кортикальным F-актином [10, 19, 34, 36, 37, 60, 64].

Протеин S100A8 индуцирует транслокацию адаптерного белка протеина 88 первичного ответа миелоидной дифференциации (MyD88) TLR4 и активирует внутриклеточные сигнальные IL-1R-ассоциированные серин-треониновые протеинкиназы (IRAK), способствуя возбуждению и перемещению в ядро клетки фактора транскрипции NF-κB [33].

Наличие трех последовательных аминокислотных гистидиновых остатков (His103–His105) в С-терминальном домене позволяет протеину S100A9 взаимодействовать с жирными кислотами, в связи с чем КП играет важную роль в их метаболизме. Предполагают, что КП является транспортным средством арахидоновой кислоты [75]. КП кальцийзависимым способом связывает арахидоновую кислоту, перемещает ее к гетеродимерному (gp91phox/p22phox) флавоцитохрому b558 (Сytb558), что активирует процесс сборки НАДФН-оксидазы [20]. Показано, что КП через субъединицу S100A8 может непосредственно взаимодействовать с p67phox, способствуя активации НАДФН-оксидазы [63].

Действие внеклеточно расположенного калпротектина (секретированного калпротектина)

Секретированный КП (сКП) оказывает влияние на клетки, взаимодействуя с гепарансульфатом, протеингликанами и карбоксильными N-гликанами наружной поверхности цитоплазматической мембраны клеток, что обусловливает активацию митоген-активированных протеинкиназ (МАРК) внутриклеточных сигнальных путей [61], индуцируя синтез провоспалительных хемокинов и молекул адгезии [62].

Гетеродимер сКП обладает цитокиноподобным действием [39]. В течение воспалительного процесса сКП принимает активное участие в миграции фагоцитирующих клеток [5, 48]. СКП способствует удержанию нейтрофилов в очаге воспаления. Это действие связано с активностью С-конца тяжелой цепи, которая по строению подобна фактору иммобилизации нейтрофилов (NIF) [15]. Протеин S100A8 является мощным хемоаттрактантом как для нейтрофилов, так и для макрофагов [55].

Субъединица сКП S100A9, по всей вероятности, оказывает опосредованное хемотаксическое действие. Так, показано, что в респираторном тракте S100A9 стимулирует продукцию IL-8, который активирует адгезию нейтрофилов к нестимулированным эндотелиоцитам и усиливает их трансэндотелиальную миграцию в очаг воспаленной ткани [2].

Под влиянием секретированных субъединиц КП — S100A9, S100A8 — индуцируется экспрессия CD11β/CD18 (Mac-1) на цитоплазматической мембране макрофагов, что ведет к возникновению устойчивой b2‑интегринопосредованной адгезии макрофагов и нейтрофилов с эндотелиоцитами (рис. 4) [38, 46, 59]. СКП активно взаимодействует с эндотелиоцитами и индуцирует продукцию тромбоспондина 1, который вызывает агрегацию тромбоцитов, способствуя развитию диссеминированного внутрисосудистого свертывания [68].

В респираторном тракте КП, секвестрируя цинк, ингибирует матриксные металлопротеиназы (ММР), которые участвуют в ремодуляции, репарации, ангиогенезе бронхопульмональной системы [61]. В свою очередь, субъединицы КП являются субстратами ММР — MMP2 и MMP9, при расщеплении которыми из протеинов S100А8 и S100А9 появляются фрагменты, изменяющие характер перемещения эозинофилов в альвеолярном пространстве. Показано, что отсутствие достаточной активности MMP2 и MMP9 сопровождается снижением концентрации Th2-хемокинов в бронхоальвеолярной жидкости [49].

Помимо хемотаксического действия, сКП вызывает и другие разнообразные иммунотропные эффекты. Так, мономер S100A8 индуцирует экспрессию скавенджер-рецептора на цитоплазматической мембране макрофагов, способствует нейтрализации гипохлорной кислоты [46]. Протеин S100A9 ингибирует антителогенез и продукцию H2O2 [7, 39, 74].

Из протеинового семейства S100 хемоаттрактантами эозинофилов являются мономеры S100A12, S100A2, а CD4+ Т-лимфоцитов — S100A7 [44, 50, 57].

Другие действия секретированного калпротектина

Гетеродимер сКП оказывает выраженное антипролиферативное действие [73], является индуктором апоптоза клеток, особенно злокачественных опухолей [30, 74]. Мономер S100A9, активируя экстрацеллюлярные протеинкиназы (ERK), индуцирует пролиферацию фибробластов [59]. Протеин S100A9 обладает анальгезирующим действием [39, 74].

Провоспалительное действие секретированного протеина S100A12

В 1999 году был идентифицирован белок семейства S100 — S100A12 (калгранулин C/внеклеточный RAGE-связанный протеин, EN-RAGE), продуцируемый гранулоцитами. В последующем было показано его участие как в неспецифической защите организма, так и в регуляции иммунной системы [41, 56].

Секретированный протеин S100A12 взаимодействует с мультилигандным рецептором RAGE (receptor for advanced glycation end products) цитоплазматической мембраны клеток. Рецептор RAGE распознает не аминокислотные последовательности, а особенности третичных пространственных молекулярных конформаций. Другими лигандами RAGE DAMP-группы являются протеин группы высокой мобильности box 1 (HMGB1), амилоид-β пептид (Aβ) [22, 67]. RAGE достаточно высоко экспрессирован на мембранах эпителиоцитов реснитчатого эпителия бронхов, альвеолоцитов II типа, альвеолярных макрофагов, на эндотелиоцитах сосудов бронхопульмональной системы. Степень экспрессии RAGE увеличивается по мере развития воспалительного процесса [17]. Учитывая, что RAGE также взаимодействует с продуктами неэнзиматического окисления и гликозилирования преимущественно лизиновых и аргининовых аминокислотных остатков протеиновых молекул (AGE — advanced glycation end products), Li Lin считает, что RAGE является особым рецептором распознавания образов, который представляет механизмы рекогниции определенных консервативных эндогенных молекулярных структур, альтернативных системе TLR, распознающей экзогенные молекулярные структуры [29].

Активация RAGE приводит к возбуждению множества сигнальных внутриклеточных киназ MAPK — экстрацеллюлярных сигнал-регулируемых киназ (ERK1/2), p38 и Jun-терминальных киназ (JNK), участвующих в индукции процесса синтеза провоспалительных цитокинов [52]. Возбуждение RAGE активирует внутриклеточные сигнальные пути, которые обусловливают индукцию фактора транскрипции NF-κB, что приводит к продукции межклеточной адгезивной молекулы 1 (ICAM-1), адгезивной молекулы 1 сосудистого эндотелия (VCAM-1), эндотелиальной молекулы адгезии лейкоцитов (ELAM), адгезивной молекулы 1 клеток слизистых оболочек (MACAM-1), TNF-α и других провоспалительных цитокинов (рис. 5) [51]. Показано, что протеин S100A12 способствует миграции эозинофилов в слизистую оболочку бронхов и усилению синтеза IgE, что подтверждает его значение в развитии бронхиальной астмы [57].

Заключение

КП и белок S100A12 — представители семейства S100 протеинов — являются компонентами системы неспе­цифической защиты респираторного тракта с провоспалительным действием. Индуцибельная продукция КП развивается в первые 4 часа инфекционного процесса. КП обладает бактериостатическим, противовирусным и фунгицидным действием, которое обусловлено его способностью связывать ионы цинка, тем самым ограничивая потребление цинка микроорганизмами. КП, как мощный хемоаттрактант для макрофагов и нейтрофилов, обладает выраженным провоспалительным эффектом и является ранним маркером макрофагально-нейтрофильного воспалительного процесса. Секретированный протеин S100A12, взаимодействуя с мультилигандным рецептором RAGE, обусловливает индукцию фактора транскрипции NF-κB, что приводит к продукции провоспалительных цитокинов. Протеин S100A12 способствует миграции эозинофилов в слизистую оболочку бронхов и усилению синтеза IgE.