Международный неврологический журнал 3 (49) 2012

Биологические аспекты специфических факторов роста

Ростстимулирующая активность некоторых веществ, относящихся к классу гормонов, а также менее изученная группа факторов роста были выявлены во второй половине прошлого столетия. Однако лишь совсем недавно начали тщательно изучать ростовой эффект некоторых веществ и были предприняты попытки выяснить механизмы их воздействия на клетки-мишени. Все эти исследования были сосредоточены преимущественно, если не сказать исключительно, на изучении гормонов, поэтому недостаточно хорошо изученный класс факторов роста случайно стал объектом анализа. В отдельных случаях исследование ограничивалось изучением эффектов вышеуказанных ростстимулирующих веществ на определенные культуры клеток в жидкой или полужидкой среде.

В данной статье обсуждаются два фактора роста, описанных в недавно опубликованных работах и изученных in vivoи in vitro. Оба фактора существенно стимулируют рост определенных типов клеток, тогда как на другие клеточные популяции не оказывают никакого влияния. Оба фактора играют важнейшую роль в жизнедеятельности клеток-мишеней. Подобные механизмы контроля могут существовать по отношению ко всем типам клеток. Признавая такую возможность, нельзя не задаться вопросом о биологической важности специфических факторов роста и их связи с гормонами.

Фактор роста нервов

В 1952 г. в результате проведения серии исследований свойств саркомы 180 и 37 на курином эмбрионе (Levi-Montalcini & Hamburger, 1951) был открыт диффундирующий фактор роста нервов (ФРН), выделяемый данными видами опухоли у мышей (Levi-Montalcini, 1952). После имплантации в стенку тела 3-дневного куриного эмбриона или в хориоаллантоисную мембрану 4–6-дневного куриного эмбриона оба вида опухоли вызывали поразительные изменения в развитии симпатического пара- и превертебрального ганглия. Ганглий существенно вырастал в размере за счет увеличения количества и размера клеток нейронов симпатического отдела. Ганглий достигал размера в 4–6 раз больше контрольного образца и продуцировал избыточное количество нервных волокон, которые образовывали крупные узлы в большинстве органов эмбриона. Они также развивались в просветах больших и малых кровеносных сосудов. Плотность таких волокон в некоторых органах, например в мезонефросе (который обычно не иннервирован), такова, что оказывает разрушительное воздействие как на их структуру, так и на функционирование.

Также отмечается не такое выраженное, но не менее существенное увеличение размера сенсорного ганглия у эмбрионов, которым трансплантировали такие же опухоли. В отличие от симпатического сенсорный ганглий восприимчив к ростстимулирующему воздействию саркомы у мышей лишь в течение непродолжительного периода их ранней дифференциации. У куриного эмбриона данный период составляет от 6 до 12 дней инкубации (Levi-Montalcini, 1963).

Ростстимулирующая активность опухоли изучалась на сенсорном и симпатическом ганглии, культивированном in vitroс применением метода висячей капли. Было показано, что в образце неопластической ткани оба вида ганглия продуцируют плотное кольцо нервных волокон в течение 8–12 часов, тогда как в контрольном образце подобного явления не отмечалось (Levi-Montalcini и др., 1954). Фактор роста, присутствующий в саркоме мыши, был выявлен в частице термолабильного белка (Cohen и др., 1954).

В то же время были открыты 2 источника подобных или очень схожих факторов роста — в яде змеи (Cohen & Levi-Montalcini, 1956) и слюнных железах мыши (Levi-Montalcini & Cohen, 1960). Предположение, что недавно открытые факторы роста нервов очень схожи, если не идентичны, с факторами роста нервов в неопластической ткани, основывалось на результатах широких биохимических исследований. При введении в желток куриного эмбриона оба фактора вызывали одинаковый ответ со стороны симпатического ганглия, как и при имплантации саркомы мыши. Их воздействие in vitroна сенсорный и симпатический ганглий идентично таковому саркомы мыши или бесклеточного экстракта опухоли мыши (Levi-Montalcini, 1958). Результаты биохимического анализа факторов роста в яде и слюне показали, что активным веществом в обоих случаях является белок (Cohen, 1958).

Для дальнейших исследований фактор роста нервов был выделен из слюнной железы мыши, поскольку там он содержится в концентрации приблизительно в 6000 раз больше, чем в опухоли мыши.

Самый чистый препарат слюнного ФРН, определен­ный как белок с осадком 4 • 3S (Cohen, 1960), был взят у новорожденной мыши. Ежедневное введение этого препарата на протяжении 9 дней обусловило рост пара- и превертебрального ганглия в 10–12 раз больше по сравнению с контрольным образцом. Такое воздействие на рост можно объяснить повышенной митотической активностью, а также увеличением индивидуальных нейронов в размере. Данные клетки вырастают гораздо большего размера, чем полностью дифференцированные нейроны взрослой мыши. ФРН у них обусловливает увеличение размера нервной клетки симпатического отдела, однако не влияет на их количество (Levi-Montalcini & Booker, 1960a). Выявленная гипертрофия и гиперплазия симпатического ганглия у пролеченных животных вызвала гипериннервацию внутренних органов, что не нарушало их нормального функционирования. Пролеченные животные в целом развивались так же, как и животные контрольной группы.

Поскольку полученные результаты свидетельству­ют о существенном росте в ответ на воздействие ФРН на нервные клетки симпатического отдела как у новорожденных, так и у взрослых особей, становится очевидным важнейшее значение ФРН для жизнедеятельности рецептивных нервных клеток.

В 1959 г. Cohen создал антисыворотку к ФРН путем введения очищенного ФРН с адъювантом Фрейнда в подушечку крыс (Cohen, 1960). Введение незначительной дозы такой антисыворотки у новорожденных млекопитающих сразу же блокировало рост и дифференциацию развивающихся нервных клеток симпатического отдела и способствовало разрушению уже дифференцированных нервных клеток. В результате наступала практически полная атрофия симпатического ганглия (Levi-Montalcini & Booker, 1960b). Исчезновение 95–98 % клеток симпатического пара- и превертебрального ганглия было подтверждено результатами гистологического анализа, проведенного у пролеченных животных спустя 1–3 года после введения антисыворотки. Со стороны других тканей и органов не отмечалось побочных эффектов. Тотальное и практически мгновенное разрушение симпатической клеточной популяции под воздействием инъекции антисыворотки к ФРН свидетельствует о том, что данные клетки не могут выжить в условиях отсутствия этого фактора роста. Подтверждением гипотезы, что ФРН играет существенную роль в жизнедеятельности нервных клеток симпатического отдела, служат также и результаты экспериментов, проведенных in vitro на ганглии с применением трипсина. В этих условиях индивидуальные нервные клетки живут и развиваются в жидкой синтетической среде, обогащенной ФРН, при молекулярной концентрации 10^–6. При отсутствии фактора роста нервов все нервные клетки сразу же распадаются и умирают (Levi-Montalcini & Angeletti, 1963).

Таким образом, мы приходим к выводу, что ФРН играет важнейшую роль в жизнедеятельности нервных клеток симпатического отдела, как никакие другие вещества (витамины, гормоны, питательные вещества). ФРН оказывает свое влияние при малых концентрациях, высокоселективен, специфичен в воздействии, в норме присутствует в рецептивных нервных клетках (Levi-Montalcini & Angeletti, 1961), и, более того, доказано, что он важен для их существования, по крайней мере в ранней фазе дифференциации.

Механизм действия ФРН, который вызывает ответ со стороны рецептивных нервных клеток, стал объектом изучения в серии исследований метаболизма (Torschi и др., 1964; Angeletti и др., 1964; Levi-Montalcini & Angeletti, 1965). Было доказано, что ФРН существенно стимулирует степень объединения аминокислот и превращение их в эмбриональные нервные клетки in vitro и в эмбриональные и взрослые нервные клетки симпатического отдела in vitro и in vivo. Таким образом, ФРН вызывает в дальнейшем еще большее повышение синтеза РНК, что доказано в экспериментах с применением меченого уридина. Результаты экспериментов с применением ингибиторов пуромицина и актомицина D дают основание предполагать, что стимуляция ФРН синтеза белка зависит от первичного влияния на синтез ядерной РНК.

Эпидермальный фактор роста

В этот же период исследования ФРН и изучения его механизмов действия ученым Stanley Cohen был открыт еще один высокоспецифичный фактор в нижнечелюстной слюнной железе мыши. Этот фактор, названный по специфике своего воздействия эпидермальным (ЭФР), присутствует в высокой концентрации в трубчатой нижнечелюстной слюнной железе взрослого самца мыши (Cohen, 1962). В этой же части железы был обнаружен и ФРН. Оба эти фактора настолько тесно взаимосвязаны, что отделить их возможно только при тщательном очищении. В неочищенном виде ФРН оказывал негативное воздействие на кожу, что и стало поводом для Cohen проводить дальнейшее очищение экстракта от ЭФР.

ЭФР также является белком. Cohen вычислил, что молекулярная масса ЭФР составляет приблизительно 14 000. Он термостойкий, не поддается диализу, разрушается при инкубации с протеолитическими ферментами и инактивируется специфической антисывороткой. Отсутствуют две аминокислоты — фенилаланин и лизин. Считается, что именно их отсутствие является критерием чистоты экстракта, «если допустить, что разложенные полипептиды могут содержать эти аминокислоты» (Cohen, 1964).

ЭФР оказывает существенное влияние на рост эпителиальных структур. При ежедневном введении новорожденным мышам ЭФР в дозе 0,5 мг на 1,5 г массы тела на протяжении 6 дней отмечалось выраженное утолщение и ранняя кератинизация кожи, а также увеличение высоты эпителия в ротовой полости, слизистой оболочке пищевода и желудка. In vitro ЭФР оказывал влияние на рост кожи у куриного эмбриона. Исследуемые образцы кожи, выращенной в среде с присутствием ЭФР в концентрации 0,1 мг/мл, очень быстро росли, тогда как контрольные образцы, выращенные в жидкой синтетической среде, оставались без изменений на протяжении первых 48 ч культивирования. В течение более длительного периода ЭФР стимулировал дальнейшую кератинизацию эпидермальных клеток.

Продуцирование факторов роста и их биологическая важность

Как было сказано выше, из трубчатой части нижнечелюстной слюнной железы взрослой мыши были выделены два высокоспецифичных и активных фактора. Их свойства изучались как на живых организмах, так и in vitro. В настоящее время проводятся исследования с целью выявить в слюнной железе другие факторы, стимулирующие рост иных видов клеток, помимо нервных и эпителиальных. Ввиду того, что в слюнной железе были выделены два фактора роста в большом количестве, рассматривается вопрос о том, синтезируются ли они и высвобождаются собственно слюнной железой, как гормоны эндокринными железами, или они вырабатываются в другом месте, а через каналы слюнной железы лишь высвобождаются. Наиболее вероятным представляется последний вариант (Levi-Montalcini & Angeletti, 1960; Levi-Montalcini, 1962). То, что ФРН присутствует в ткани саркомы и гранулемы мышей, дает основание предполагать (Levi-Montalcini & Angeletti, 1960), что данный ростстимулирующий фактор может продуцироваться в любом месте организма мезенхимальными клетками и использоваться нервными клетками. Если эта гипотеза окажется правильной, тогда мы столкнемся с необходимостью дать ответ на вопрос: почему этот фактор присутствует в большом количестве в слюнной железе мыши и ядовитой железе змеи, однако отсутствует в слюнных железах других позвоночных? Также предстоит выяснить, существуют ли другие специфические факторы роста, подобные описанным выше, и если да, то взаимосвязаны ли они с гормонами.

Существующее сегодня неточное определение категории факторов роста отражает наше незнание значения данной группы веществ. С одной стороны, они обладают свойствами, сходными с таковыми гормонов. С другой стороны, они во многом отличаются от них по важным аспектам. Согласно определению в «Кратком оксфордском словаре», гормон — это вещество, которое образуется в каком-либо органе и служит для стимулирования жизненно важных процессов. Такие вещества, как известно, вырабатываются в специфических эндокринных железах.

Два данных специфических фактора роста, ФРН и ЭФР, не соответствуют этому определению гормонов. Нам точно неизвестно, что они образуются в определенном органе или органах. Их первичный эффект заключается в стимуляции роста клеток, но они не влияют на функционирование последних. Было отмечено более быстрое размножение и избыточный рост нервных клеток симпатического отдела. Обильная иннервация органов у эмбрионов волокнами симпатических нервных клеток, а также проникновение их в кровеносные сосуды наряду со значительным ростовым ответом свидетельствуют о том, что избыточный рост симпатической системы имеет скорее негативное, чем благоприятное воздействие на организм в целом.

Влияние антисыворотки на ФРН подтверждает мнение о том, что ФРН имеет очень большое, если не основополагающее значение для жизнедеятельности клеток-мишеней. Об этом также свидетельствует тот факт, что нервные клетки могут жить и расти только при наличии ФРН, чего нельзя сказать о гормонах, которые стимулируют рецептивные органы или ткани, но не являются жизненно необходимыми для их жизни и роста.

Последнее, но не менее важное отличие между гормонами и факторами роста — это временной фактор. Гормоны проявляют свое действие в достаточно отдаленном периоде. И хотя можно говорить о влиянии гормонов уже у плода, однако в полной мере оно проявляется в поздний фетальный период, когда организм уже сформировался. Факторы же роста, наоборот, очень важны именно в ранний период роста и дифференциации клеток-мишеней. Действительно, некоторые виды клеток, например сенсорные нервные, чувствительны к ростовому эффекту ФРН очень ограниченный период, а именно на ранней фазе своего роста. Даже симпатические нервные клетки, которые реагируют на данное вещество на протяжении всей жизни, максимально проявляют ответные реакции в ранний период дифференциации. Все это можно сказать и об эпидермальном факторе роста.

Есть все основания предполагать, что специфические факторы роста, подобные описанным выше, являются частью фундаментальной системы. Они могут быть метаболитами, выделяемыми клетками, которые не организовались в определенные органы, и используемыми другими клетками в качестве факторов роста. Поскольку основная роль данных веществ — это стимулировать рост клеток, которые отвечают на их воздействие, наиболее подходящим термином для них на сегодня является именно «факторы роста». Не стоит исключать возможности изменения термина по мере накопления нами более точных и глубоких данных.