Журнал «Здоровье ребенка» 8 (51) 2013

Алергічні захворювання (АЗ) сьогодні посідають вагоме місце в різноманітті хвороб дитячого віку, оскільки вони не тільки погіршують життя хворих, але й пов’язані із суттєвим економічним навантаженням на державу та хворого.

Як відомо, основна мішень фармакологічних агентів при лікуванні хронічних алергічних захворювань — це запалення слизових оболонок або шкіри. Алергічне запалення має свої особливості й опосередковується багатьма клітинами та медіаторами. У випадку контакту з алергеном (наприклад, пилком рослин) відбувається така послідовність подій, що призводять до розвитку ураження слизових оболонок верхніх відділів респіраторної системи або бронхів (частіше за все). Пилок потрапляє на слизову оболонку та завдяки фактору проникності проходить крізь епітелій, набрякає, лускається, його внутрішній вміст усмоктується в кров та лімфу, що викликає відповідь імунної системи. Первинна дія алергену готує слизову оболонку до таких контактів, робить її більш чутливою. Цей феномен отримав назву «праймуючого ефекту». У результаті при наступній провокації кількість пилкових часток, яка необхідна для появи симптомів полінозу, знижується в декілька десятків разів. Феномен праймування пояснює виникнення симптомів без наявності головного тригеру та призводить до «мінімального персистуючого запалення» слизової оболонки, яке залишається протягом декількох тижнів після алергенної провокації навіть при отриманні пацієнтом протизапальної терапії [1, 9, 10]. В умовах відсутності лікування медіаторні взаємодії призводять до ремоделювання слизової оболонки, наслідком чого є фіброзування тканини.

Сьогодні створення нових ліків спрямоване на пригнічення алергічного запалення. Тому розуміння механізмів, які його зумовлюють, є першочерговим завданням наукових пошуків. Одним із пояснень існування «мінімального персистуючого запалення» виступає уповільнення процесів загибелі запальних клітин [3, 17].

В організмі людини існує два можливих шляхи загибелі клітин — апоптоз та некроз. Загальним етапом розвитку для них є деградація ДНК. Некроз — це не програмована, патологічна форма загибелі, яка розвивається у відповідь на пошкодження клітини надмірної сили та супроводжується формуванням класичних ознак запалення. Апоптоз — енергозалежний процес, що активується внаслідок реалізації генетично запрограмованої клітинної загибелі (ПКЗ) або як відповідь на зовнішні стимули, потребує синтезу молекул de novo (біохімічне визначення) та проявляється зменшенням розміру клітини, конденсацією, фрагментацією хроматину, ущільненням зовнішньої та цитоплазматичної мембран без виходу лізосомальних ферментів назовні (морфологічне визначення) [1, 13]. Фактор програмованості та активний характер процесу є більш принциповими, але зазвичай використовують термін «апоптоз».

Захворювання з участю апоптозу поділяють на 2 групи: внаслідок уповільнення або прискорення останнього. АЗ супроводжуються інгібіцією ПКЗ, проявляючись у легенях персистуванням запалення, дезорганізацією епітелію та посиленням фіброзування тканин. Механізми регуляції апоптозу досить складні та практично не змінилися в процесі еволюції, що підкреслює його фундаментальну біологічну роль. Після отримання сигналу «смерті», а іноді й за відсутності необхідного сигналу в клітині розвивається два послідовних процеси: у мембрані з участю рецепторів смерті та в цитоплазмі внаслідок активації специфічних ферментів (каспаз), що призводить до ушкодження ДНК та безпосередньої апоптотичної загибелі клітини [14]. Сенсорами позаклітинних сигналів до апоптозу є розташовані на поверхні клітин рецептори, а сигналом виступає відповідний ліганд. При АЗ переважає загибель запальних елементів через систему Fas/FasL, що належить до суперродини ФНП­. Ця система включається в елімінацію інгаляційних чужорідних субстанцій та призводить до видалення активованих Т­лімфоцитів, що і є необхідним елементом у зменшенні алергічного запалення. У разі полінозу, на думку деяких учених, саме уповільнення Fas­опосередкованого апоптозу є причиною гіперпродукції IgE та інших медіаторів алергії [11, 23].

Fas (APO­1/СD95) — один із трьох відомих рецепторів, що проводять сигнал клітинної смерті. Він, як і інші рецепторні протеїни, існує у зв’язаному з мембраною або вільному стані (розчинній формі) без втрати активності. У найбільшій кількості Fas експресується на нейтрофілах, гепатоцитах, Т­лімфоцитах­хелперах, що характеризує їхню велику чутливість до FasL­індукованого апоптозу. Мембранний рецептор постійно вивільняється в позаклітинний простір та формує розчинну фракцію, залишаючись стабільним на поверхні клітини для адекватного проведення сигналу [21]. При цьому експресія Fas на Т­клітинах збігається з кількістю апоптотичних клітин, що виявляють іншими методами [12, 13, 16]. Взаємодія Fas­рецептора з його натуральним лігандом призводить до активації вищенаведених механізмів. Лігандом для Fas виступає FasL (APO­1L/CD178). Згідно з теорією ліганд­рецепторних взаємодій, провідну роль у проведенні сигналу та запуску ПКЗ має ліганд. Для його активації потрібно три молекули рецептора. Тримеризація ліганду активує домен смерті (death domain), що, у свою чергу, сприяє активації каскаду каспаз, серед яких найбільшу активність у розщепленні білків має каспаза­3: після її активації клітина втрачає здатність до виживання [15, 19, 20].

Крім того, у здорових дітей класичні рецептори апоптозу, у тому числі й Fas, можуть проводити як проапоптотичний, так і антиапоптотичний сигнали. Вибір залежить від дози ліганду, його функціонального стану, типу та наявності інших клітин з про­ або протиапоптозною активністю. Дослідженнями останніх років доведено, що додавання до культури тканин таких прозапальних цитокінів, як IL­9 або IL­13, призводить до редукції спонтанного апоптозу епітеліальних клітин легенів за рахунок послаблення проапоптотичних ефектів Fas [12, 20]. Тобто в організмі здорових людей за відсутності підвищених концентрацій прозапальних медіаторів Fas опосередковує проведення проапоптозних сигналів, а в атопіків, у разі підвищених концентрацій IL­13, — антиапоптозних.

Значущу роль Fas/FasL­системи в патогенезі полінозу доводить збільшення рівнів цих цитокінів під впливом алергенспецифічної імунотерапії (АСІТ) причинними алергенами [19, 22]. Дані, які отримують учені щодо рівнів Fas та FasL при різних клінічних проявах полінозу, досить суперечливі. Деякі дослідники свідчать, що рівень Fаs­рецептора у пацієнтів із бронхіальної астмою (БА) прямо корелює з тяжкістю, періодом та тривалістю захворювання і вищий за рівень здорових. Інші — що при БА (в тому числі і пилкової етіології) його рівень нижчий, ніж у здорових [2, 5, 11]. Згідно з дослідженням M. Kato зі співавт. (1999), у пацієнтів із пилковим алергічним ринітом (АР) рівні Fas були вірогідно нижчими, ніж у здорових пацієнтів, а у хворих на пилкову БА — вищими. У той же час у разі поєднання астми з ринітом його рівень був нижчим, ніж при ізольованій БА [17, 23]. Згідно з даними інших дослідників (Mezei Gyorgyi зі співавт., 2006), поєднання пилкової БА та АР характеризується вищими цифрами Fas. При цьому різниці між періодами (загострення або ремісія) дослідники не відмічають. У разі приєднання до пилкової інших видів сенситизації (при сполученні цілорічних та сезонних форм) виникає підвищення рівня sFas. Щодо змін у кількості ліганду існує не так багато робіт: дослідження, проведене у дітей з полінозом, зареєструвало більш високі рівні ліганду, ніж у здорових [4, 18].

Таким чином, імунологічні зміни при полінозі свідчать про переважання патерну прозапальних цитокінів, що призводить до персистенції запалення та зумовлює необхідність пошуків терапевтичних стратегій, здатних розірвати це порочне коло. Єдиним на сьогодні підходом до лікування, що може бути корисним у подоланні алергічного запалення, є АСІТ.

Базовий ефект АСІТ — це індукція клінічної та імунологічної толерантності до специфічних алергенів. Це можливе за рахунок тривалої десенситізації із залученням механізмів, що змінюють алергенспецифічну пам’ять імунокомпетентних клітин. У літературі існують деякі дані і стосовно впливу терапії на зміни у рівні розчинної форми Fas­рецептора. Так, у дітей з АЗ пилкової етіології рівень Fas­рецептора після клінічно успішних курсів АСІТ причинними алергенами вірогідно підвищувався [19, 22].

Тому метою нашої роботи стало дослідження особливостей Fas/FasL­опосередкованого апоптозу та експресії розчинної форми рецептора IL­13Ra2 при полінозах у дітей залежно від їх клінічного варіанту та оцінка змін у цих системах при включенні АСІТ у схеми лікування.

Матеріали та методи

Під нашим спостереженням знаходилося 104 дитини з полінозами, які дали згоду на участь у дослідженні. У 77 (74,04 %) з них було діагностовано бронхіальну астму у поєднанні з ринокон’юнктивітом (АСРК/АСР). Ці діти склали першу групу. Інші 27 (25,96 %) — діти з ізольованим АСРК/АСР — 2­гу групу. Контрольну групу (група 3) становили 18 здорових дітей. Групи були однорідними за статтю, віком та тривалістю захворювання. Дизайн дослідження представлений на рис. 1.

Дітям груп порівнння та контрольної групи було проведене загальноклінічне обстеження, спірометричне дослідження, проведена оцінка імунологічних тестів 1­го та 2­го рівнів, а також визначення в сироватці крові концентрацій sFas та sFasL та sIL­13Ra2. Визначення sIL­13Ra2, sFas та sFasL (не пов’язаних із мембраною форм) проводилось на аналізаторі для ІФА в Центральній науково­дослідній лабораторії ЗДМУ. Статистичну обробку проводили на ПЕВМ з використанням ліцензійного програмного забезпечення Statisticа for Windows 6.1.RU, серійний номер AXXR712D833214SAN5. За статистично значимий був прийнятий рівень р < 0,05.

Подальшим етапом була оцінка ефективності різних схем терапії. Лікування проводили згідно з існуючими вітчизняними та міжнародними протоколами з лікування полінозів, АР та БА. АСІТ проводилась моно­ (амброзія) та полікомпонентними вакцинами (мікст максимум 5 алергенів) передсезонно, за 5–6 місяців до передбачуваної палінації причинних рослин. Початкова доза алергену підбиралась методом алергометричного титрування. Загалом схема проведення, окрім строків початку, не відрізнялась від класичної, рекомендованої провідними алергологами нашої країни [8]. Фармакотерапія загострень включала основні групи препаратів, що використовують для лікування АР та БА, і полягала в більш ранньому призначенні максимально допустимого обсягу терапії, враховуючи особливості пилкової алергії (масивний викид пилку в повітря, у зв’язку з чим формується його велика концентрація, що діє одночасно на слизові оболонки хворих дітей).

Оцінка ефективності лікування проводилась через рік на підставі комплексного клініко­імунологічного обстеження (проводилось визначення вищезазначених показників). Для оцінки ефективності терапії групи було переформовано залежно від отримуваного лікування.

Результати дослідження та їх обговорення

У результаті проведеного дослідження концентрації розчинної форми Fas­рецептора (табл. 1) було встановлено, що у дітей з полінозами його вміст знижений до 341,83 ± 105,90 пг/мл проти 1149,93 ± 115,12 пг/мл у здорових дітей (р < 0,01).

Ці результати збігаються з дослідженням Є.Є. Орлової та співавт. (2002) [6], але відрізняються від даних закордонних дослідників, які свідчать, що при БА (не уточнюється етіологічний чинник), навпаки, реєструється збільшення sFas у періоді загострення, тим вище, чим тяжчий перебіг [3, 6]. Вказану невідповідність ми пов’язуємо з тим, що при полінозах відбувається одночасна дія великої кількості алергену, за рахунок чого sFas підлягає найшвидшій утилізації і не встигає синтезуватись de novo.

На рис. 2 наочно показано рівні вмісту рецептора, що втричі менші за показники здорових дітей. При цьому концентрація рецептора у дітей 1­ї та 2­ї груп відрізняється досить незначно (всього декілька десятків одиниць (пг/мл)). Це свідчить про ідентичність змін в організмі пацієнтів з рослинною алергією незалежно від рівня ураження респіраторної системи.

На відміну від кількості розчинної форми рецептора вміст ліганду в сироватці крові дітей груп спостереження вдвічі перевищує його рівень, який ми визначаємо у здорових, і становить 248,40 ± 20,68 пг/мл при наявності БА та 252,17 ± 26,34 пг/мл без неї. Різниця з показниками здорових статистично вірогідна (р < 0,05).

На рис. 3 показано відмінності у вмісті sFasL серед здорових та хворих на поліноз дітей. Звертає на себе увагу те, що не тільки середні значення, але й стандартні відхилення вмісту sFasL у дітей із полінозами незалежно від наявності або відсутності астми однакові (р > 0,05).

Виявлені нами зміни кількості sFas та sFasL у дітей з полінозами при порівнянні зі здоровими дітьми та відсутність вірогідної різниці всередині групи хворих свідчать про однакові механізми клітинної загибелі, які мають місце у дітей з пилковою астмою та без неї. Це збігається з даними інших дослідників [7].

Результати дослідження представлені в табл. 2.

Як показано в табл. 2, у здорових дітей відмічаються вищі, ніж у хворих на поліноз, рівні цього показника, що становлять 765,6 проти 272,5 пг/мл (р < 0,05). Тобто в дітей із полінозом зареєстровано майже втричі нижчі рівні sIL­13Ra2, що підтверджує теоретичні припущення й пояснює гіпрепродукцію IgE. Між групами (1 та 2) ми не знайшли вірогідних відмінностей, що свідчить про ідентичність змін незалежно від рівня ураження дихальної системи.

Отримані нами відомості дозволили оцінити ефективність терапії без урахування клінічного варіанту полінозу. Динаміка маркерів апоптозу під впливом лікування подана в табл. 3.

Бачимо, що вже після першого курсу АСІТ мікстом смітникових трав реєструється статистично вірогідне підвищення рівня sFas, що підтверджується сильним прямим кореляційним зв’язком цього показника до та після лікування (r = +0,91, р < 0,0001).

Зміни середніх значень sFas під впливом різних схем терапії наочно наведені на рис. 4.

Якщо на тлі проведення АСІТ відбувається підвищення рівня рецептора, то за умови її відсутності після 1 року рівень sFas зменшується. За рахунок невеликої кількості спостережень (n = 4) ми не отримали статистичної вірогідності, але сильний прямий кореляційний зв’язок (r = +0,8, р > 0,05) підтверджує наше припущення.

Попередні дані, отримані нами, показали, що рівні sFasL у дітей із полінозами вищі, ніж у здорових дітей. Такі імунологічні зміни, можливо, пояснюються компенсаторним збільшенням ліганду з метою прискорення процесів програмованої смерті запальних клітин.

Під впливом терапії (табл. 3) кількість ліганду зростає незалежно від схеми лікування. Його збільшення як у разі використання АСІТ, так і без неї говорить про недостатнє, хоча і вірогідне підвищення під впливом АСІТ рівня рецептора (рис. 5).

Щодо змін концентрації рецептора sIL­13Ra2, то у пацієнтів, які отримували АСІТ, відмічено підвищення в два рази порівняно з рівнем до лікування (табл. 4, рис. 6). У хворих групи порівняння, яким призначали симптоматичне лікування, відмічено тенденцію до зниження рівня sIL­13Ra2 удвічі.

Таким чином, результати проведеного дослідження підтверджують протективну роль АСІТ причинними алергенами щодо підвищення рівня sIL­13Ra2, який блокує активність прозапального медіатора IL­13.

Таким чином, АСІТ сприяє зменшенню алергічного запалення за рахунок активації процесів апоптотичної загибелі імунокомпетентних клітин, що беруть участь у процесі запалення. На підставі отриманих даних ми можемо стверджувати, що зміни, які виникають на тлі проведення АСІТ пилком бур’янів, через рік після цієї терапії вже помітні, але ще недостатні для адекватної активації процесів апоптозу та повної елімінації запалення, що підтверджує необхідність проведення АСІТ протягом декількох років. Тривалість АСІТ та кількість курсів потребує уточнення, що є метою нашої подальшої роботи.