Журнал "Гастроэнтерология" 4 (50) 2013

Статья опубликована на с. 43-49

Проблеми діагностики та лікування хронічних вірусних гепатитів (ХВГ) набувають все більшої актуальності. У світі, за попередніми підрахунками ВООЗ, станом на 2012 р. нараховувалось близько 150 млн осіб, тобто 2,5 % населення земної кулі, хворих на ХВГ, викликаний вірусом гепатиту С (HCV) (ХВГ С) [1].

В Україні офіційна реєстрація хронічних форм вірусних гепатитів В і С проводиться з червня 2009 р. і не охоплює все населення, у зв’язку з чим існує невідповідність між офіційними українськими та міжнародними статистичними даними. У 2010 р. в Україні зареєстровано близько 3,0 % громадян, інфікованих HCV, що становить приблизно 1 170 000 осіб [2]. У 2012 р. захворюваність на ХВГ С в Україні порівняно з 2009 р. зросла на 63,4 % та становила 11,49 випадку на 100 тис. населення [3].

Визначальним фактором у патогенезі хронічної патології печінки різної етіології є прогресування запальних і фібротичних процесів із формуванням цирозу печінки (ЦП) [4]. Трансформація гострого гепатиту С у хронічну форму спостерігається в 75–85 % випадків [1], а впродовж 10–30 років приблизно у 25–35 % хворих на ХВГ С розвивається фіброз та ЦП [5]. При цьому чим вища активність гепатиту, тим швидше розвивається цироз, що супроводжується різноманітними ускладненнями та є найбільш частою причиною смерті при патології шлунково­кишкового тракту, посідаючи 7 місце серед усіх причин смерті від неонкологічних захворювань [4]. Більше ніж 350 тис. осіб щорічно помирають від захворювань печінки, асоційованих із вірусом С, у тому числі від гепатоцелюлярної карциноми [1].

Своєчасна діагностика ранніх стадій фіброзу при ХВГ та можливість контролювати його у хворих на ЦП залишається актуальним питанням сучасної медицини.

Фіброз — універсальна генетично закладена реакція на пошкодження, що характеризується надмірною кількістю сполучної тканини в результаті як посилення її утворення, так і сповільнення швидкості її руйнування.

Головними ланками фіброзу печінки є вплив етіологічного чинника (вірусу гепатиту С), запальне ураження гепатоцитів, активація імунних клітин, трансформація зірчастих клітин печінки та надмірний синтез компонентів екстрацелюлярного матриксу (ЕЦМ) із наступним сповільненням процесу деградації колагену.

Кількісні показники тяжкості та швидкості прогресування фіброзу — найважливіші клінічні параметри, визначення яких має вирішальне значення для правильної діагностики фіброзу, вибору терапії та моніторингу її ефективності [7].

На сьогодні для визначення стадії фіброзу лікарі у своєму арсеналі мають як інвазивні, так і неінвазивні методи діагностики.

Золотим стандартом діагностики фіброзу є пункційна біопсія печінки з наступним морфологічним дослідженням біоптату, що дозволяють встановити діагноз, визначити ступінь активності запалення та вираженість фіброзу, моніторувати процеси фіброзування під час проведення специфічної терапії та після її завершення [4, 7].

Однак використання пункційної біопсії печінки має певні обмеження: наявність печінкової недостатності, асциту, можливі ускладнення (кровотеча, гемоперитонеум, біліарний перитоніт, пневмоторакс та ін.), «помилки попадання», відмова хворого від проведення процедури [7].

Вибором у цих випадках є неінвазивні методи діагностики фіброзу печінки, серед яких розрізняють методи візуалізації та лабораторні методи діагностики.

Ультразвукове дослідження (УЗД), комп’ютерна томографія, магнітно­резонансна томографія органів черевної порожнини, допплерівське дослідження судин печінки найбільш часто використовуються для виявлення захворювань печінки, однак чітких критеріїв оцінки фіброзу печінки, особливо на ранніх стадіях, вони не мають. Еластометрія печінки (фіброскан) — єдиний метод візуалізації, що дає кількісну оцінку стадії фіброзу.

Сироваткові маркери фіброзу М. Пінцані [8] розподіляє на 4 групи:

1) ензими, що беруть участь у синтезі ЕЦМ (лізил­, пролілгідроксилаза);

2) молекули ЕЦМ (гіалуронова кислота (ГК), колаген IV або VI типу, ламінін (ЛН));

3) попередники зрілих форм колагену (амінотермінальний пропептид проколагену ІІІ, карбокситермінальний пропептид колагену I типу, пропептид колагену IV типу);

4) ензими, що беруть участь у регуляції деградації ЕЦМ (матриксні металопротеїнази (ММР), тканинні інгібітори металопротеїназ (TIMP).

Найбільш поширеним є розподіл сироваткових маркерів фіброзу на прямі та непрямі [7]:

1. Прямі маркери характеризують: а) метаболізм у клітинному матриксі (фіброгенез і фіброліз) та/або б) зміни в зірчастих клітинах, які домінують в профіброзних клітинах. Це фрагменти клітинного матриксу печінки, утворені зірчастими клітинами, та молекули, що беруть участь в регуляції процесів фіброгенезу: ГК, колаген IV і VI, амінотермінальний фрагмент проколагену III (P3NP), ММР і TIMP­1.

2. Непрямі маркери — молекули, що вивільняються в кров у результаті запального процесу, що проходить в печінці, зокрема, це:

1) аланінамінотрансфераза (АЛТ) та аспартатамінотрансфераза (АСТ);

2) молекули, що синтезуються, регулюються або секретуються печінкою, — аполіпопротеїн А1, альфа­2­макроглобулін (А2М), феритин, гаптоглобін;

3) фактори згортання;

4) маркери холестазу: холестерин і білірубін, лужна фосфатаза (ЛФ) та γ­глутамілтранспептидаза (ГГТП);

5) маркери патологій, що виникають при пошко­дженні функції печінки, наприклад інсулінорезистентності.

На підставі розрахунку співвідношень окремих маркерів або їх комбінацій розроблений ряд індексів та діагностичних панелей, що доводять свою вагомість в оцінці процесів фіброзування: FibroTest, ActiTest, FibroMaxTest (FibroTest, ActiTest, NashTest, AshTest, SteatoTest), ELF.

Неінвазивні методи оцінки ступеня фіброзу печінки в пацієнтів із гепатитом С включені в рекомендації Європейської асоціації з вивчення печінки (The European Association for the Study of the Liver, EASL) [5].

Завдяки своїй доступності та безпечності, легкості відтворення сироваткові маркери фіброзу мають перспективу стати обов’язковими для моніторингу захворювань печінки з тривалим періодом розвитку [4].

Мета дослідження: вивчити діагностичну значимість сироваткових маркерів процесів фіброзування у хворих на HCV­інфекцію.

Матеріали та методи

Під спостереженням перебувало 50 хворих на хронічну HCV­інфекцію віком від 20 до 71 (48,6 ± 9,8) року: з них 26 жінок (52,0 %) та 24 чоловіки (48,0 %). І групу становили 26 хворих на ХВГ С. У ІІ групу увійшли 24 хворі на ЦП, асоційований із вірусом С (ЦП С) класу А та В за Чайлд — П,ю. Вірогідної різниці за статтю та віком між групами не було (рис. 2).

Тривалість захворювання становила від 1 до 22 років.

Діагноз встановлювали на підставі клініко­анамнестичних даних, даних УЗД, виявлення в сироватці крові маркерів вірусної інфекції (антитіл до HCV, підтверджених наявністю РНК HCV).

Лабораторні дослідження включали загальноклінічні, біохімічні, імуноферментні методи з наступною статистичною обробкою отриманих результатів.

Найбільш доступним є визначення непрямих маркерів фіброзу, серед яких вивчали активність АЛТ, АСТ, ЛФ, ГГПТ, рівень загального білірубіну, холестерину; показники синтетичної функції печінки — протромбіновий час (ПТЧ), альбумін та γ­глобуліни; рівень тромбоцитів.

Активність АЛТ та АСТ сироватки крові визначали за колориметричним динітрофенілгідразиновим методом Ратмана — Френкеля, концентрацію загального білірубіну в сироватці крові досліджували колориметричним діазометодом за Йєндрашиком, Клеггорном, Грофом [9].

Активність (тяжкість) запального процесу в печінці оцінювали за рівнем АЛТ. Якщо рівень АЛТ підвищувався до 3 норм, активність розцінювали як мінімальну, від 3 до 5 норм — як помірну. Виражену активність процесу встановлювали при підвищенні АЛТ понад 5 норм.

Активність ЛФ сироватки крові досліджували за методом Боданського [9]. ПТЧ визначали за уніфікованим методом із використанням тромбопластин­кальцієвої суміші [9].

Уміст холестерину, ГГТП, загального білка та білкових фракцій у сироватці крові досліджували, використовуючи набори біотесту «Філісіт­діагностика».

Серед прямих маркерів фіброзу у сироватці крові вивчали рівень ГК, оксипроліну вільного (ОПв) та білковозв’язаного (ОПб/з), ЛН, ММР­1.

Вміст ГК досліджували за E.W. Gold [10], ОП б/з та ОПв — за Осадчуком [11].

ММР­1 та ЛН визначали імуноферментним методом [12] із використанням наборів реактивів фірми R@D та Bender Medsystems відповідно.

Для більш детальної оцінки процесів фіброгенезу в обстежених хворих проводили розрахунок тестів, заснованих на співвідношеннях прямих та непрямих маркерів фіброзу, ефективність яких була доведена багатьма зовнішніми дослідженнями [13].

Тест AAR — коефіцієнт співвідношення АСТ/АЛТ — використовується як метод оцінки тяжкості хронічних захворювань печінки [14]. APRI­тест — індекс зіставлення АСТ та кількості тромбоцитів, що розраховували за спеціальною формулою [15]. Тест Forns’ score включав такі параметри, як ГГТП, холестерин, кількість тромбоцитів, вік [16]. У тесті FibroIndex [17] використовували показники АСТ, γ­глобуліну, кількості тромбоцитів. Тест FIB­4 [18] розроблений із застосуванням таких параметрів, як вік, активність АЛТ, АСТ та кількість тромбоцитів. Тест MDA [19] розраховували за показниками альбуміну, тромбоцитів, АЛТ, АСТ, ЛФ. Тест GUGI заснований на комбінації АСТ, тромбоцитів та ПТЧ [20]. Формула підрахунку тесту SHASTA включає такі параметри, як ГК, АСТ, альбумін [21].

Також визначали коефіцієнт (k) ЛН, k ММР­1 та їх співвідношення — k ЛН/ММР­1, що розроблені співробітниками ДУ «ІГ НАМН України» [22].

Результати дослідження

При загальноклінічному обстеженні відмічались типові для НСV­інфекції прояви: больовий та астенічний синдроми, що за частотою виявлення переважали у хворих на ЦП С (83,3 проти 73,0 % та 69,2 проти 34,6 % відповідно) (рис. 3, 4).

Типові для хворих ІІ групи спленомегалія (100,0 проти 11,5 %, р < 0,01), розширення ворітної та селезінкової вен (83,0 проти 0 %, р < 0,01), асцит (31,8 проти 0 %, р < 0,05), які є проявом розвинутого фіброзу та портальної гіпертензії, підтверджені при УЗД.

Середньогрупова характеристика непрямих маркерів фіброзу в дослідних групах подана в табл. 1 і суттєво не відрізнялася між групами.

АЛТ та АСТ вважають найбільш чутливими й специфічними індикаторами гепатоцелюлярного по­шкодження (запалення та некрозу гепатоцитів).

При внутрішньогруповому аналізі в І групі підвищення активності АЛТ у 6,9 раза встановлено практично в усіх обстежених (92,7 %) (р < 0,001). При цьому переважали помірна та мінімальна активність запального процесу (рис. 5). Виражена активність цитолізу встановлена в дев’ятої частини хворих.

Подібна тенденція визначалась із боку активності АСТ: її зростання встановлено у 84,6 %, хоча воно було менш вираженим, ніж АЛТ, — в 4,1 раза порівняно з контролем (р < 0,001).

У хворих ІІ групи підвищення активності АЛТ також виявлялось у переважної частини обстежених (87,5 %) та було менш вираженим, ніж у І групі — у 6,4 раза (р < 0,001). Мінімальна активність запального процесу визначалась в 1,4 раза частіше, ніж у І групі, — у 54,2 % хворих (р > 0,05). Помірна активність, навпаки, була встановлена в 1,4 раза рідше, ніж у І групі (р > 0,05), — у 29,2 % пацієнтів, що, імовірно, пов’язано зі зменшенням частки функціонуючої паренхіми печінки. Активність АСТ також була підвищена у 79,2 % хворих у 4,7 раза (р < 0,001).

Збільшення рівня загального білірубіну до (38,8 ± 25,4) мкмоль/л у 19,2 % хворих на ХВГ С свідчило про наявність ознак холестазу. Зростання активності ЛФ до (3,73 ± 0,80) ммоль/л • год хоча й перевищувало контрольний показник у 3 рази (р > 0,05), але визначалось лише в кожного дев’ятого з обстежених хворих І групи. Підвищення ГГТП у 2,5 раза до (2,05 ± 0,09) мккат/л спостерігалось у третини пацієнтів І групи (36,0 %), зниження вмісту холестерину — у 19,2 % хворих у 1,3 раза до (3,17 ± 0,01) ммоль/л.

З боку показників, що характеризують гепатоцелюлярну недостатність, встановлено вірогідне (р < 0,001) зниження ПТЧ більше ніж у чверті хворих (26,9 %).

При ЦП С збільшення загального білірубіну було більш вираженим (у 2,2 раза) — до (42,5 ± 31,1) мкмоль/л (р < 0,05) та спостерігалось частіше, ніж у І групі, — у 29,2 %. Зростання вмісту ГГТП спостерігалось до тих же значень, що і в І групі, але в меншої кількості хворих (25,0 %). Зниження вмісту холестерину визначалось частіше, ніж у І групі: у 62,5 % — у 1,9 раза (до (2,76 ± 0,15) ммоль/л), що є прогностично несприятливим фактором та свідчить про прогресуючий розвиток печінкової недостатності.

Зниження ПТЧ у ІІ групі спостерігалось менше ніж у половини обстежених (у 45,8 %), але в 1,7 раза частіше, ніж у І групі, однак вираженість цих змін щодо групи контролю не мала суттєвої різниці (р < 0,001).

Дефіцит вмісту альбуміну було виявлено в 46,2 % хворих I групи — до (50,4 ± 6,3) г/л та в 54,2 % пацієнтів IІ групи — до (46,5 ± 4,8) г/л, підвищення вмісту γ­глобулінів в 1,3 раза встановлено в половини хворих I групи та в 1,5 раза — у 62,5 % ІІ групи.

Кореляційні зв’язки між активністю АЛТ та АСТ свідчать про поглиблення запально­некротичних змін у гепатоцитах: у І групі r = 0,86; р < 0,001, у ІІ групі r = 0,50; р < 0,05. Запально­некротичні зміни в печінці стали основою для подальшого порушення функції печінки, що підтверджено кореляційними зв’язками у хворих ІІ групи між підвищенням активності трансаміназ та рівнем загального білірубіну: АЛТ/загальний білірубін (r = 0,96; р < 0,001), АСТ/загальний білірубін (r = 0,96; р < 0,001).

Рівень тромбоцитів як показник тяжкості фіброзу печінки у хворих І групи суттєво не відрізнявся від показників контролю, а в ІІ групі був зниженим в 1,6 раза.

Середньогрупова характеристика прямих маркерів фіброзу подана в табл. 2.

У хворих обох груп встановлена достатньо висока активність процесів утворення сполучної тканини.

Вміст ГК, що є компонентом ЕЦМ та визнана кращим біомаркером фіброзу печінки, у 61,5 % хворих І групи вірогідно підвищувався у 2,2 раза — до (1,76 ± ± 0,11) г/л (p < 0,001). Таке підвищення її синтезу є характерною відповіддю на запалення гепатоцитів на фоні зниження її виведення.

У ІІ групі підвищення вмісту ГК в 2 рази до (1,63 ± ± 0,16) г/л (p < 0,001) спостерігалось частіше — у 79,2 % обстежених.

У хворих обох груп (у 61,5 та 58,3 % відповідно) відмічалось збільшення вмісту ОПб/з, який є маркером синтезу колагену, в 1,2 раза до (166,38 ± 5,04) мкмоль/л (р < 0,001) на тлі зниження у 34,6 та 37,5 % хворих І та ІІ груп в 1,9 раза вмісту в сироватці крові ОПв, що характеризує уповільнення колагенолізу та активний розвиток фіброзу печінки.

Також були встановлені кореляційні зв’язки між запально­некротичними змінами та обміном колагенів: ОПб/з/АЛТ (r = 0,32; р < 0,04) та ОПв/ЛФ (r = 0,37; р < 0,025) у І групі та ОПв/білірубін (r = 0,55; р < 0,019), ОПб/з/білірубін (r = 0,51; р < 0,033) — у ІІ групі.

Підвищення рівня ЛН — структурного глікопротеїну ЕЦМ — спостерігалось практично в усіх хворих обох груп, та більш значиме зростання (у 2 рази) встановлене у хворих на ЦП С (р < 0,05), що дало підстави вважати концентрацію ЛН сироватки крові достатньо чутливим біомаркером для скринінгу печінкового фіброзу.

Рівень ММР­1 — ферментів, що денатурують надлишок колагенів, у хворих І групи незначно відрізнявся від контрольних значень. У групі хворих на ЦП С встановлено їх вірогідне зниження в 1,5 раза, що свідчить про руйнування ММР та виснаження механізмів, які протидіють фіброзу.

Ми провели розрахунок деяких індексів, заснованих на співвідношеннях прямих та непрямих сироваткових маркерів фіброзу, чутливість та специфічність яких була підтверджена багатьма зовнішніми дослі­дженнями (табл. 3).

У І групі тест AAR в усіх хворих показав запальний тип ураження печінкової тканини. У ІІ групі цей показник зростав майже у 2,1 раза (р < 0,05) та свідчив про некротичний тип ураження печінкової тканини.

Розрахунок тесту APRI дозволив встановити виражений фіброз у хворих ІІ групи та мінімальний ступінь фіброзу в обстежених І групи.

Результати тесту Forns’ score у хворих на ЦП С в 1,5 раза перевищували розрахункові показники хворих на ХВГ С (р < 0,001).

Комбінація маркерів тесту FibroIndex вважається достатньо ефективною для визначення фіброзу навіть у пацієнтів із нормальною АЛТ. Однак значення тесту в групі хворих на ЦП С лише в 1,2 раза перевищувало показник І групи (р > 0,05).

Значення тесту FIB­4 та GUGI у хворих на ЦП С у 2,1 раза перевищували показники І групи (р < 0,01 та р < 0,05 відповідно) та дали змогу диференціювати мінімальний фіброз та цироз.

Негативний показник тесту MDA показав вірогідність наявності ЦП у хворих ІІ групи, і навпаки, позитивний результат тесту виключив тяжкий фіброз у хворих І групи (р < 0,01).

Дані тесту SHASTA між групами суттєво не відрізнялись.

Розрахунок індексів фіброзу з використанням таких маркерів, як ЛН та ММР­1, розроблених в ДУ «ІГ НАМНУ», показав, що k ЛН від 1,5 до 2 був притаманним хворим І групи і свідчив про початкову стадію фіброзу. Його зростання понад 2 було характерним для хворих на ЦП С (р = 0,053). Коефіцієнт ММР­1, навпаки, у хворих ІІ групи не перевищував 1 (р < 0,01).

Більш чутливим стало співвідношення k ЛН/ММР­1. Значення коефіцієнта k ЛН/ММР­1 від 1 до 2 відповідало початковій стадії фіброзу, від 2,5 та вище — ЦП.

Таким чином, у хворих на хронічні дифузні захворювання печінки, асоційовані з вірусом С, виявлена висока активність запального процесу з ознаками холестазу, що є підґрунтям для розвитку та прогресування фіброзу.

Встановлено перевагу процесів синтезу колагену над його розпадом, порушення метаболізму таких компонентів ЕЦМ, як гіалуронова кислота та ламінін, що мають односпрямованість змін як при хронічному гепатиті С, так і при цирозі печінки С. Виявлено виснаження захисних механізмів, що протидіють фіброзу (за рівнем ММР­1), особливо у хворих на ЦП С.

Розраховані індекси на основі співвідношення прямих та непрямих маркерів фіброзу можуть бути використані для неінвазивної діагностики фіброзу печінки. Найбільшу інформативність показали тести AAR, Forns’ score, FIB­4, MDA, GUGI, k ММР­1 та k ЛН/ММР­1. Визначення стадії фіброзу неінвазивними методами діагностики доцільно проводити з використанням декількох тестів, що дає змогу більш об’єктивно оцінити стадію фіброзу.

Дослідження виконані на базі біохімічної та імунологічної лабораторій ДУ «Інститут гастроентерології НАМН України».