Газета «Новости медицины и фармации» 6 (495) 2014

Статья опубликована на с. 20-25 (Укр.)

Нанообъекты — это огромный мир в диапазоне наноразмеров. К ним относятся как наночастицы известных веществ, полученные путем их дезагрегирования или конденсирования, так и искусственно созданные конструкции, способные переносить генетическую информацию (искусственные генетические конструкции) или осуществлять механические действия (наномеханизмы). D.M. Goncalves et al. [23] пишут о необходимости формирования новой ветви токсикологии — нанотоксикологии, т.е. науки, изучающей потенциальную опасность наноструктур и наномеханизмов. Цель настоящей работы — обозначение контуров проблемы поражающего действия нанообъектов.

Границы наномира

Наномир представлен структурами нанометрового диапазона размеров (1 нм = 10^–9 м = 10^–6 мм = 10^–3 мкм), но это не значит, что если объект измерять нанометрами, то мы проникнем в наномир. Размер атомов и атомных молекул около 0,1 нм, но наноструктурой отдельный атом не является. В химии принято считать, что наноструктурой становится результат самоконденсации атомов и молекул в малые атомные агрегации (кластеры), являющиеся промежуточным звеном между изолированными атомами и молекулами, с одной стороны, и массивным (объемным) твердым телом — с другой. Отличительной чертой кластеров атомов (молекул) от исходных атомов (молекул) является немонотонная зависимость свойств от количества атомов в кластере. Переход к твердому телу осуществляется через укрупнение кластеров — минимальное число атомов в кластере равно двум, верхняя граница соответствует числу атомов, когда добавление еще одного атома не меняет свойства кластера, так как переход количественных изменений в качественные уже закончился. Обычно такая структура соответствует 1–2 тыс. атомов и является границей между кластером и изолированной наночастицей. Следовательно, нижняя граница наномира начинается в диапазоне размеров от 1 до 4 нм, т.е. с образованием твердого тела — наночастицы. Верхнюю границу наномира определяют свойства приповерхностного слоя наночастицы. Дело тут в том, что доля атомов (a), находящихся в тонком приповерхностном слое (~1 нм), растет с уменьшением размеров частички вещества R, поскольку a ≈ S/V ≈ R²/R³ ≈ ≈ 1/R, где S — поверхность частички, V — ее объем. Атомы, дислоцирующиеся на поверхности частички, обладают свойствами, отличающимися от объемных, поскольку они связаны с окружающими их атомами по-другому, чем в объеме. В результате ненасыщенности связей на поверхности наночастицы может произойти атомная реконструкция и появится новый порядок расположения атомов. На свободных поверхностях могут находиться атомы и молекулы, адсорбированные из внешней среды; дополнительные особенности появляются в окрестностях атомов, находящихся на краях моноатомных террас, уступов и впадин. Взаимодействие электронов со свободной поверхностью тоже приводит к возникновению специфических приповерхностных явлений. Возникают и другие эффекты, более подробно о них можно узнать в специальной литературе (например, из монографий Головина Ю.И. [1] и Суздалева И.П. [4]). Все это, вместе взятое, позволяет химикам рассматривать приповерхностный слой частиц, у которых соотношение числа атомов (молекул), лежащих на поверхности, больше или равно объемным, как некое новое состояние вещества. Внешне оно проявляется резким увеличением химической и каталитической активности поверхности, увеличением ее сорбционной емкости и другими эффектами. Поэтому в химии под наночастицами понимают те, у которых отношение числа поверхностных атомов (молекул) к объемным ≥ 1. При таком определении наночастицами низкомолекулярных веществ считаются объекты с размером до 10 нм, высокомолекулярных — до 100 нм.

Первое боевое применение частиц нано- и субмикронных размеров

После появления во второй половине 1916 г. на фронтах мировой войны угольных противогазов многие военные специалисты считали, что теперь противогаз победил газ. Однако в июле 1917 г. германские военные во Фландрии доказали своим противникам обратное. И дело было не только в том, что были применены новые отравляющие вещества (ОВ) раздражающего действия — арсины (дифенилхлорарсин, адамсит, дифенилцианарсин). Изменилось агрегатное состояние боевых отравляющих веществ. В отличие от использовавшихся ранее фосгена, хлора, синильной кислоты, при боевом применении переходивших в парообразное состояние, арсины представляют собой твердые вещества. Температура кипения дифенилхлорарсина — 333 °С, адамсита — 277,5 °С, дифенилцианарсина — 346 °С. Их плавили и заливали в стеклянные емкости, затем эти емкости помещали в корпус снарядов и заливали тротилом. Снаряды маркировались синим крестом. При взрыве тротила арсины превращались в пар и мгновенно конденсировались с образованием наноагрегатов размером менее 100 нм (предел разрешения методов измерения размеров частиц в то время). Такой способ образования наночастиц называется сегодня самоконденсацией. Для получения наночастиц заданного размера и структуры он выполняется в специальных камерах и атмосфере инертного газа низкого давления с последующей конденсацией пара в охлаждающей среде или на охлаждающих устройствах. Но в 1917 г. размер и структура получаемых твердых частиц арсинов германское командование не интересовали. Целью применения таких снарядов было заставить солдат противника сбросить противогазы и вдохнуть пары фосгена и дифосгена, образовавшиеся в результате одновременного обстрела химическими снарядами другого типа, маркировавшихся зеленым крестом (рис. 1).

Частицы арсинов свободно преодолевали угольные фильтры противогазов и вызывали у солдат сильный рвотный рефлекс. Борьба с такими дымами оказалась более сложной, чем с ОВ, применявшимися в парообразном состоянии. До конца войны не было создано удовлетворительных противодымных фильтров. Артиллерийская подготовка, проводимая одновременно химическими снарядами синего и зеленого крестов, получила у германских военных красивое название — «стрельба разноцветным крестом» [3].

Особенности наночастиц, обусловливающие их поражающее действие

Прежде всего это химическая и каталитическая активность поверхности наночастиц, отсутствующая у этого же вещества при более крупной дисперсности частиц. Вторая особенность наночастиц, проявляющейся их токсичностью, — высокая концентрация в воздухе при незначительном количестве самого распыленного вещества. Например, 10 мкг/м³ вещества образует более чем 1 • 10⁶ частиц/см³ при их размере в 20 нм. Третья особенность наночастиц, проявляющаяся их токсическими свойствами, — способность к ингаляционному, трансдермальному, транснейральному и энтеральному проникновению в любые органы и ткани человека, включая центральную нервную систему (ЦНС). Четвертая особенность наночастиц, проявляющаяся генотоксическим действием, — способность проникать в ядра неделящихся клеток, если диаметр частиц менее 40 нм, т.е. размера внутренней полости поры ядра клетки [2, 13]. Физические свойства частиц наноразмеров, определяющие их распространение в организме человека и поражающее действие, приведены в табл. 1.

Наночастицы по размеру сходны с рецепторами клеток и молекулами, осуществляющими сигнальную функцию внутри клетки. Исследования, проведенные в условиях in vitro с использованием различных клеточных систем, показали развитие у клеток, экспонированных к наночастицам, провоспалительных и связанных с окислительным стрессом реакций [13, 18, 23, 34] (рис. 2).

Токсическое действие наночастиц на культуры клеток зависит от типа клетки-мишени, условий среды, в которой произошло взаимодействие наночастицы с клеткой, химического состава наночастицы, ее размера, формы, химии поверхности и дозы [53].

В условиях in vivo наночастицы вызывают различные патологические реакции. В зависимости от способа проникновения в организм человека и физических свойств (табл. 1) они могут оказывать разрушительное действие на легочную ткань, проявлять нейро-, дермо- и генотоксичность. Без экспериментального исследования на лабораторных животных наночастиц конкретного вещества, структуры, определенного диапазона дисперсности и степени агрегации частиц их патологическое действие можно только предполагать. Однако даже если оно установлено в эксперименте или эпидемиологическим исследованием, необходимо понимать, что это действие воспроизводимо только в тех условиях, в которых оно обнаружено. На другие условия эксперимента мы можем его только экстраполировать, как это показано на рис. 3 для наночастиц, оказывающих нейротоксическое действие.

Например, при исследовании в условиях in vitro ответов микроглии на частицы кварца размером 200 нм обнаружено, что они не обладают токсическим эффектом даже при высоких концентрациях (292 мкг/мл). Частицы того же вещества размером 50 нм уменьшают количество живых нейронов дозозависимым образом [6]. Наночастицы меди размером 40 нм обладают максимальным токсическим эффектом на соматосенсорные нейроны в сравнении с таким же эффектом, оказываемым наночастицами меди размером 60 и 80 нм [47].

При патологических эффектах нанообъектов, проявившихся в уcловиях in vivo при одном способе введения, прослеживается определенная специфичность, обусловленная их структурой и химическим строением. Например, агрегированные одностеночные углеродные нанотрубки в легочной ткани мышей индуцируют образование гранулем, главным образом связанных с гипертрофией эпителиальных клеток. Эти же трубки, но в диспергированном состоянии, вызывают развитие диффузного интерстициального фиброза с утолщением стенок альвеол.

Внутренний объем нанотрубок может быть заполнен токсическими соединениями биологической и химической природы. Стенки нанотрубок исключат взаимодействие биологических компонентов с клетками иммунной системы и последующие иммунные ответы. Благодаря достижениям в конструировании таких структур стала возможной доставка биологически активных веществ и генов в клетки, очень трудные для трансфекции, включая В-клетки и первичные нейроны [22, 36].

Искусственные генетические конструкции

Разрабатываются в рамках технологий генной терапии наследственных и инфекционных болезней. Предназначены для доставки генов в клетки-мишени. В настоящее время сформировалось два альтернативных направления их создания — на основе вирусов и на основе искусственных векторных систем (табл. 2).

Искусственные генетические конструкции на основе вирусов в организме человека имитируют поведение вирусной частицы, но не вызывают инфекционный процесс. В их состав входят: белки вируса, формирующие оболочку частицы, способную к узнаванию клеток-мишеней и к интернализации в цитоплазму; и трансген-экспрессирующая кассета, осуществляющая после доставки в клетку длительную экспрессию одного или нескольких генов.

Наибольшее распространение в практике генной терапии наследственных и инфекционных болезней приобрели векторные системы на основе лентивирусов, аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, ортопоксвирусов, герпесвирусов и отдельных РНК-вирусов (вирусов гриппа, бешенства, везикулярного стоматита, кори, респираторно-синцитиальной болезни, лихорадок Синдбис, Сендай, ВЭЛ и др.), не относящихся к ретровирусам.

Искусственные векторные системы разрабатываются по трем направлениям: комплексы, образованные нуклеиновыми кислотами и катионными полимерами (полиплексы); комплексы, образованные нуклеиновыми кислотами и липидами (липоплексы); комплексы на основе наночастиц двуокиси кремния. На рис. 4 показаны механизмы формирования первых двух комплексов и их проникновения в клетку.

Третьим направлением получения искусственных векторных систем, развитие которого прослеживается только с 2005 г., стало использование наночастиц двуокиси кремния в качестве носителя терапевтических генов. Их основными преимуществами перед липо- и полиплексами разработчики считают низкую токсичность, контролируемость размеров и простоту приготовления векторной системы [10, 14].

Наиболее распространенным вариантом конструирования искусственных векторных систем стало создание комплексов наноразмеров, подвергающихся декомплексации в эндосомах и высвобождающих ДНК трансгена в цитоплазму. Нанополиплексы размером меньше 25 нм эффективно трансфецируют неделящиеся клетки, так как они меньше, чем размеры пор в мембране ядра. Нанополиплексы стабильны в солевых растворах. Конденсированный пептид, содержащий в своей структуре тридцатимерный полилизин с цистеином на N-конце, к которому «пришит» 10-кДа ПЭГ, при температуре 4 °C стабилен в солевом растворе более трех лет; 9 мес. он сохраняет свои основные свойства при комнатной температуре и один месяц — при температуре 37 °C [17].

Перечисленные подходы к конструированию искусственных векторных систем позволяют разрабатывать векторы с тонко управляемой специфичностью для направленной доставки трансгенов в целевые клетки (в печень, надпочечники, глубокие отделы мозга, медуллярные двигательные нейроны, костные ткани, гладкую мускулатуру кровеносных сосудов, легочную ткань, опухоли эндотелия и др.).

Пути проникновения нанообъектов в организм человека

Их не менее шести — через легкие, обонятельный эпителий, кожу, желудочно-кишечный тракт, барьеры глаза и парентерально. Наиболее доступны для наночастиц легкие. В газообменной области альвеол барьер между альвеолярной стенкой и капиллярами очень тонок, всего 500 нм, и легко проницаем для объектов наноразмеров [30]. Распространение наночастиц по дыхательным путям показано на рис. 5.

До 90 % ингалированных 1-нм частиц оседает в назофарингеальном тракте, до альвеол они «не доходят». 5-нм частицы распределяются относительно равномерно по назофарингельному тракту, трахеобронхиальному тракту и альвеолам (~ по 30 %). Частицы диаметром в 20 нм наиболее эффективно оседают в альвеолах (~ 50 %). В то же время в трахеобронхиальном и назофарингеальном регионах задерживается ~ по 15 % от их общего количества.

Скорость проникновения нанообъектов из легких в кровеносное русло варьирует для наночастиц разных размеров и химического состава. В некоторых случаях этот процесс может осуществляться очень быстро. A. Nemmar et al. [42] установили, что ингалированные углеродные частицы размером менее 100 нм уже через одну минуту после экспозиции можно обнаружить в крови экспериментального животного.

По данным H.S. Choi et al. [15], некатионные наночастицы размером менее чем 34 нм способны перемещаться из легких в лимфатические узлы средостения. Такие же наночастицы размером < 6 нм проникают из легких в кровь, а затем выводятся из организма почками. Нано-частицы, покрытые сурфактантом, выстилающим стенки альвеолы, более эффективно проникают через альвеолярно-капиллярную мембрану (alveolar-capillary membrane), чем частицы, не имеющие такого покрытия [7].

Наибольшим токсическим потенциалом для легочной ткани обладают углеродные нанотрубки (carbon nanotubes, CNT). Их диаметр измеряется в нанометрах, длина может достигать сотен микрон. Такие структуры имеют сходство с нитями асбеста. Экспериментальные результаты, полученные в условиях in vitro F.A. Murphy et al. [40], показывают, что прямое экспонирование к CNT ведет к значительному цитокиновому выбросу макрофагами, но не клетками мезотелия. Выраженность этих провоспалительных ответов макрофагов зависит от длины нитей CNT. Она меньше, чем ожидалось при проведении аналогии с нитями асбеста. К тому же действие CNT на клетки мезотелия носит непрямой характер. Мезотелиальные клетки реагируют на цитокины, выброшенные макрофагами во время незавершенного фагоцитоза CNT. Поэтому авторы выдвинули гипотезу, что этот механизм лежит в основе воспаления, развивающегося в плевральной полости человека в ответ на проникновение туда нанонитей. Данные по острой легочной токсичности CNT приведены в табл. 3.

Своеобразной новинкой для токсикологов, характерной именно для частиц нанодиапазона, является возможность их проникновения в ЦНС по нервным волокнам, идущим от обонятельного эпителия и сетчатки глаза (рис. 6).

D.H. Jo et al. [32] показали проникновение в мозг через сетчатку глаза наночастиц золота размером 20 нм, введенных внутривенно.

Установлены три пути проникновения частиц наноразмеров через кожу: в промежутки между клетками, через клетки и через волосяные фолликулы. Например, липоплексы с размерами в пределах от 20 нм до 200 нм легко «проходят» между клетками. Проникновение в организм человека через кожные покровы для наночастиц облегчается тонкостью верхнего слоя кожи, эпидермиса. Лежащий же под ним слой — дерма богат макрофагами крови и тканей, лимфатическими узлами, дендритными клетками, и в него выходят окончания сенсорных нервов пяти различных типов; все эти «обитатели» дермального слоя способны поглощать и распространять нанообъекты за пределы их первоначальной аппликации [44].

S.S. Tinkle et al. [58] продемонстрировали способность неповрежденной кожи в местах сгиба, например в области запястья, становиться проницаемой для наночастиц. L. Mortensen et al. [39] опубликовали экспериментальные данные, показывающие значительное увеличение проницаемости кожи для наночастиц после ультрафиолетового облучения.

При внутривенном введении способность нанообъектов распространяться в организме животного и человека зависит от их размеров. Например, частицы золота размером 10 нм при внутривенном введении крысе были обнаружены в крови, печени, селезенке, почках, яичках, тимусе, сердце и мозге. Частицы этого же вещества, но более крупного размера (50, 100, 250 нм), обнаружены только в крови, печени и селезенке экспериментального животного [33]. D.H. Jo et al. [32] показали способность введенных внутривенно частиц золота размером 20 нм проникать во все слои сетчатки глаза, включая нейрональный, эндотелиальный, и периэндотелиальные глиальные клетки, однако частицы золота размером 100 нм не проникали в ткани сетчатки. Из циркулирующих в крови наночастиц ГЭБ способны преодолевать катионные наночастицы и, в высоких концентрациях (!), анионные наночастицы [35].

Кишечник значительно более проницаем для наночастиц, чем для частиц микронного размера, благодаря тому, что поверхность его слизистой оболочки имеет поры диаметром до 100 нм. Положительно заряженные наночастицы проникают в кровеносное русло через кишечник значительно быстрее, чем отрицательно заряженные. Чем меньше размер частицы, тем меньшее влияние на скорость ее проникновения оказывает ее заряд [21].

Подробно с токсическими свойствами нанообъектов, производимых промышленным путем, можно ознакомиться по работам [12, 38, 52, 56]. В табл. 4 приведены примеры острой системной токсичности нанообъектов в условиях эксперимента.

Случай группового поражения людей наночастицами двуокиси кремния (по Y. Song et al. [54, 55])

С января 2007 г. по апрель 2008 г. в Beijing Chaoyang Hospital в Пекине поступили 7 женщин в возрасте от 19 до 47 лет (средний возраст — 29 лет), работавших на одном предприятии. Все они жаловались на одышку и затрудненное дыхание. Объективно при поступлении: поверхностное дыхание; гипоксемия, но без задержки углекислоты; на лице, кистях рук и предплечьях интенсивная зудящая сыпь. Ультразвуковое исследование позволило обнаружить у всех пациенток плевральные выпоты, у пяти из них перикардиальный выпот глубиной 4–8 мм. Других патологических изменений со стороны сердца, почек и печени не выявлено.

Ранее они проходили лечение в местных больницах, которое включало многократный торакоцентез, выполняемый для удаления жидкости из плевральной полости; антибиотикотерапию; антитуберкулезное лечение; преднизолон и метилпреднизолон. Все пациентки работали в одном плохо вентилируемом помещении площадью 70 м², с одной дверью и без окон. В помещении установлена машина для воздушного распыления полиакрилатов на листы оргстекла и последующего нагревания и высушивания полученных поверхностей. Поликрилатные покрытия обычно содержат связующее вещество, пигменты, растворители, наполнители и добавки. Наполнители и добавки представляют собой композиционные материалы, содержащие диоксид кремния, сульфат бария, карбонат кальция, силикаты (тальк, слюда или каолин).

Даже спустя 20 мес. после поступления в Beijing Chaoyang Hospital у пациенток обнаруживали ослабленное дыхание, продолжающееся истечение жидкости в плевру и медленнопрогрессирующий легочный фиброз. У двух пациенток (случаи 1 и 5) плевральный выпот образовался чрезвычайно быстро, что потребовало установить непрерывный дренаж плевральной полости. В сутки врачи откачивали 300–800 мл плевральной жидкости. Наиболее тяжелой 19-летней пациентке (случай 5) через 18 мес. после начала болезни было выполнено оперативное вмешательство на грудной клетке под видеонаблюдением (VATS). Процедура включала фенестрацию (прокол) перикарда и откачивание почти 170 мл жидкости из перикардиального пространства, декортикацию плевральных фиброзных пластинок (decortication of pleural fibrous lamina), клиновидную резекцию плевры, легочную биопсию и дренаж плевральной жидкости. Через 24 ч после VATS у пациентки развился тяжелый пневмоторакс, на 10-е сут. — острая перикардиальная тампонада, которые не удалось купировать. Пациентка умерла на 16-е сут. после хирургического вмешательства на фоне легочной недостаточности. Течение болезни у 29-летней пациентки (случай 5) было сходным с вышеописанным. Она умерла от легочной недостаточности в местном госпитале через 21 мес. после появления первых симптомов болезни.

Общие анализы мочи у пациенток при поступлении в стационар были в пределах нормы. Общий анализ крови обнаружил моноцитоз с увеличением абсолютного количества моноцитов и нейтропению, с уменьшением абсолютного количества нейтрофилов, повышенную СОЭ, гипопротеинемию, повышенные уровни ALT и AST. Спирометрия показала снижение легочного объема. Иммунологические тесты были в пределах нормы.

Рентгенография и компьютерная томография грудной клетки показали наличие у всех пациенток плеврального выпота, у 5 из них — перикардиальный выпот. У 4 пациенток — диффузные затемнения в легких, у 6 — узелки в легочном интерстиции, у 3 трех — аденопатия лимфатических узлов (lymph node adenopathies). Не обнаружено плевральных бляшек (pleural plaques), утолщений плевры (pleural thickening) и узлов (pleural nodules). У всех пациенток выявлено воспаление легочного интерстиция и легочный фиброз. После 7 мес. наблюдения у двух пациенток (случаи 1 и 5) замечено быстрое прогрессирование легочного интерстициального фиброза и у одной — образование кальцификатов в плевральной полости (случай 1).

Всем пациенткам была выполнена бронхоскопия, у 4 обнаружено увеличение и гиперемия слизистой оболочки бронхов (tunica mucosa bronchiorum). В жидкости бронхоальвеолярного лаважа количества макрофагов снижено, лимфоцитоз, нейтрофилез, количество эозинофилов соответствовало норме. Трахеобронхиальная легочная биопсия показала скопления фагоцитов, воспалительных клеток и белковые выпоты в альвеолярных пространствах, набухшие и расширенные альвеолярные септы с нейтрофильными лейкоцитами и участки легочного фиброза. Tunica mucosa bronchiorum инфильтрирована воспалительными клетками.

Торакоскопия, проведенная у трех пациенток, позволила обнаружить у двух из них ровные уплотнения на поверхности плевры, не имеющие отношения к злокачественным образованиям. Биопсия плевры и жидкости показала наличие гранулем, вызванных наличием инородного тела (foreign-body granulomas), геморрагии, воспалительные клетки.

Изучение грудной полости с помощью VATS позволило обнаружить отсутствие слипания плевральных листков. На биопсию были взяты участки плевры. С легочной поверхности плевры, где рассеяны маленькие туберкулы, взяты гистологические образцы из участков, соответствующих верхней, средней и нижней долям легкого. Световая микроскопия гистологических препаратов не дала ничего специфического: фиброзные уплотнения на поверхности плеврального листка; эмфиземоподобные изменения легочных альвеол; расширение альвеолярных септ; отложение коллагеновых нитей; капилляры расширены, заполнены лимфоцитами; альвеолярные пространства инфильтрированы фагоцитами; в альвеолах встречаются многоядерные гигантские клетки; пролиферация альвеолярных эпителиальных клеток II типа.

Трансмиссионная электронная микроскопия дала более интересные результаты. Легочная ткань была повреждена. Обнаружены легочный интерстициальный отек; признаки гиперплазии и дегенерации пневмоцитов второго типа, почти утративших микроворсинки; уплотнение базальной мембраны альвеолярных эпителиальных клеток первого типа. Клетки сосудистого эндотелия имели признаки повреждения: они были увеличены, наблюдалась вакуолизация клеточных органелл и уплотнение базальной мембраны. В газообменной области альвеол барьер между альвеолярной стенкой и капиллярами был нечетким и значительно более толстым, чем в норме (норма ~ 500 нм).

На поздней стадии болезни повреждения легких, описанные выше, были более выраженными. Барьер между альвеолярной стенкой и капиллярами в газообменной области альвеол был практически неразличим. В альвеолярном пространстве находили эритроциты, что указывало на наличие альвеолярной геморрагии и отека. Обнаружен легочный фиброз с пролиферацией фибробластов и фибринозный некроз. Плевральные мембраны отечные, рыхлые, с признаками фиброза и неясной клеточной структурой. Большое количество макрофагов образовывали агрегаты, что показывает их участие в развитии патологического процесса.

У пациентов на ранней стадии болезни (три месяца после появления первых симптомов) в цитоплазме, ядре и органеллах макрофагов, микрососудах легких, эндотелиальных клетках легочных сосудов и в микролимфатических сосудах, в жидкости плеврального выпота были обнаружены наночастицы неизвестной природы диаметром ~ 20–21 нм. В альвеолярных эпителиальных клетках и интерстициальных тканях их тоже находили, но в значительно меньших количествах. Размер наночастиц в жидкости плеврального выпота был меньшим, чем в тканях легких, что говорит о размерозависимой транслокации наночастиц по тканям легких. Чтобы установить химическую природу наночастиц, использовался метод энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (EDX). Он показал, что большинство наночастиц состоит из двуокиси кремния (рис. 7).

На поздней стадии болезни (18 мес. от начала появления симптомов) небольшое количество наночастиц двуокиси кремния было обнаружено в пульмонарных клетках (pulmonary cells), ткани интерстиция (interstitial tissue) и в макрофагах. Однако в ядрах и цитоплазме альвеолярных эпителиальных клеток были обнаружены отдельные нитчатые наноструктурные включения (длиной ~ 70 нм), сформировавшие сложные агломераты или пересекающие мембраны ядер альвеолярных эпителиальных клеток. Используя EDX, исследователи установили, что нитчатые наноструктуры содержат Fe, Ca, Mg, но не Si. Эти структуры не были обнаружены в легочной ткани пациентов, что говорит о том, что они не имеют отношения к легочной патологии.

Нацеливание искусственных генетических наноконструкций на отдельные типы клеток человека

Для искусственных генетических конструкций на основе вирусов задача повышения или даже изменения их специфичности к отдельным типам клеток решается следующими путями:

- физический таргетинг (physical targeting) — заключается в том, что вирусная частица покрывается специальной оболочкой, изменяющей ее природный тропизм и делающей ее неузнаваемой для иммунной системы. В качестве такой оболочки используют полимеры (полиэтиленгликоль, poly-[N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide, pHPMA]) или вирусную частицу включают в биодеградируемую альгинатную микрочастицу. Природный тропизм вектора заменяется селективным таргетингом (selective targeting), т.е. в эти полимеры вводятся различные таргетирующие лиганды (пептиды, белки или антитела). Другой стратегией для физического таргетинга стало использование биспецифических адапторных молекул (биспецифические антитела или белки слияния), состоящих из двух компонентов: один из них с высокой специфичностью связывается участком капсида искусственной генетической конструкции, другой с высокой специфичностью связывает рецептор клетки-мишени. Обе стратегии физического таргетинга в основном используются для изменения специфичности векторов на основе аденовирусов, однако они дают плохо воспроизводимые результаты [50]. Поэтому физическому таргетингу исследователи предпочитают генетическую модификацию векторов на основе вирусов;

-генетический таргетинг (genetic targeting) — объектом модификации генно-инженерными способами становятся белки капсида вируса, играющего основную роль в специфическом узнавании клеток-мишеней. Для векторов на основе аденовирусов объектом модификации обычно является волокнистый «набалдашник» капсида, играющий основную роль в специфическом узнавании аденовирусом клеток-мишеней, и, в частности, расположенные на нем два участка — C-конец и HI-петля [50].

Для векторов на основе лентивирусов эта задача может решаться благодаря псевдотипированию вируса. Смысл методического приема в следующем. Так как из лентивирусной векторной системы удален собственный оболочечный ген env ВИЧ, то его можно заменить другим, направляющим синтез оболочечного гликопротеина другого вируса, чью специфичность исследователям необходимо использовать для введения генов в клетки-мишени. Такие вирусы называют псевдотипированными (pseudotyping), или вирусами-обманщиками [46].

Например, химерный гликопротеин RD114, полученный благодаря слиянию трансмембранного и внеклеточного доменов гликопротеина эндогенного ретровируса кошачьих (feline endogenous virus RD114) с цитоплазматическим доменом гликопротеина амфотропного вируса MLV 4070A, позволяет псевдотипированному вектору эффективно трансдуцировать мезенхимальные стволовые клетки (mesenchymal stem cells, MSCs) с очень низкой цитотоксичностью [62].

Лентивирусные векторы, псевдотипированные с гликопротеинами оболочки вируса бешенства (PV-штамм), приобретают тропность к нейрональной ткани и способность к ретроградному транспорту в условиях in vivo. Введенный в периферическом участке нервной системы псевдотипированный лентивирусный вектор по нейрональным аксонам доставил трансгены в ЦНС [19]. Подробно стратегия использования таких векторов для целей генотерапии описана в работах [16, 20, 46, 60].

Для искусственных векторных систем задача повышения специфичности к отдельным типам клеток решается путем введения в их поверхность лигандов, специфически взаимодействующих с рецепторами на поверхности клеток-мишеней. Введение в состав липосомы галактолипидов повышает их тропность к паренхиматозным тканям. Липосомы, содержащие dimethylaminoethane-carbamoyl-cholesterol (DC-Chol), обладают повышенной тропностью к клеткам гиппокампа головного мозга¹ [28]. Другой путь таргетирования липоплексов — введение в их состав специфических антител. Такие комплексы называются пегилированными иммуносомами (PEGylated immunoliposomes, PILs). Они сохраняют коллоидную стабильность при внутривенном введении и эффективно доставляют гены в ЦНС [45, 62].

Наибольшую эффективность при доставке генов в ЦНС показали полиплексы на основе PEI. Их трансфецирующая активность превосходит таковую у векторов, полученных на основе ВИЧ-1, сопоставима с трансдуцирующей активностью аденовирусов, но уступает векторам на основе HSV [9].

Тонкое управление специфичностью искусственных векторных систем стало возможным благодаря обнаружению на поверхности нейронов нескольких классов рецепторов, с которыми взаимодействуют нейропептиды, нейротрофины и нейротоксины. Для перенацеливания искусственных векторных систем с одного участка мозга на другой в их состав включают таргетинговые группы, соответствующие отдельному классу рецепторов (табл. 5).

Эффективная нейрон-специфическая трансфекция искусственных векторных систем достигается введением в их оболочку химерного белкового комплекса, включающего четвертую петлю фактора роста нервов (nerve growth factor, NGF) или шпилечный мотив, содержащий петли 1 и 2 NGF, слитый с ДНК-связывающим доменом из 10 лизиновых последовательностей [61]. Трансфецирующая активность в отношении нейронов, сравнимая с трансдуцирующей активностью HSV, в условиях in vivo показана для наночастиц (~ 30 нм), созданных на основе кремния, модифицированного путем добавления аминогрупп (amino-terminated organically modified silica, ORMOSIL), и комплексированных с плазмидной ДНК [10].

Наряду с разработкой типовых структур искусственных векторных систем для направленной доставки трансгенов в целевые клетки (в печень, мозг и надпочечники, в медуллярные двигательные нейроны, в костные ткани, гладкую мускулатуру кровеносных сосудов, в опухоли эндотелия и др.) в 1990-е годы была оптимизирована структура трансгена. Для того чтобы трансген мог автономно функционировать в данной ткани, в него включают соответствующие регионы транскрипции и инициации мРНК, регуляции терминации транскрипции.

Нацеливание искусственных генетических наноконструкций на отдельные участки генома человека

В первом десятилетии текущего века наиболее распространенным подходом к нацеливанию ретровирусного вектора на конкретные участки в геноме человека было использование в составе вирусной частицы слитых белков, образующих вирусный преинтеграционный комплекс, импортирующийся вовнутрь нуклеуса. Такие белки обычно включают IN-белок (вирусная интеграза), полученный из ВИЧ-1, и ДНК-связывающие последовательности клеточных и бактериальных белков, слитых с N- или C-концом IN. Чтобы вирус не утратил инфекционности, слитые белки вводят в вирион ВИЧ-1вместе с исходным IN (wild-type IN). Одна из используемых моделей нацеливания ретровирусных векторов на конкретные участки ДНК в геноме человека (таргетинговой интеграции) показана на рис. 8.

Случаи поражения людей искусственными генетическими наноконструкциями

Такие поражения имели место при введении людям искусственных генетических наноконструкций на основе аденовирусов и ретровирусов.

Наиболее тяжелые генетические последствия наблюдали при терапевтическом использовании ретровирусных векторов для лечения пациентов с тяжелым комбинированным иммунодефицитом, связанным с Х-хромосомой (X-linked severe combined immunodeficiency, X-SCID). Иммунодефицитное состояние у таких пациентов возникает из-за мутации в гене гамма-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (interleukin-2 receptor subunit gamma gene, IL2RG), общей для рецепторов IL-2, -4, -7, -9, -15, -21.

Эти интерлейкины и их рецепторы вовлечены в процессы развития T- и B-лимфоцитов. Без функционирования Т-клеток невозможна активизация В-клеток. Ген IL2RG находится на Х-хромосоме. Мутация в гене IL2RG приводит к инактивации общей гамма-цепи рецепторов интерлейкинов, и, как следствие, нарушаются процессы сигнализации, в которых они участвуют. Происходит почти полный отказ иммунной системы с отсутствием или очень малым количеством T-лимфоцитов, NK-клеток и нефункциональными B-лимфоцитами. Дети с X-SCID погибают от инфекции в течение года [57].

Так как X-SCID вызван мутацией в одном хорошо охарактеризованном гене, его лечение путем введения пациенту полноценного гена в конце 1990-х годов представлялось исследователям одним из самых перспективных направлений в генотерапии. Группой французских исследователей из костного мозга 9 пациентов в возрасте от 1 до 9 мес. были получены аутологичные гемопоэтические стволовые клетки CD³⁴⁺. Эти клетки культивировали в условиях ex vivo и трансдуцировали ретровирусным вектором на основе вируса мышиной лейкемии Молони, в который включили ген IL2Ryc человека. Затем клетки вводили обратно пациентам. Функция Т-клеток постепенно восстановилась. В течение нескольких месяцев количество Т-клеток и натуральных киллеров в крови у 8 пациентов достигло нормы. Был установлен минимальный порог количества трансдуцированных клеток, которое необходимо ввести пациенту для достижения терапевтического эффекта, — 1•10⁶ – 3•10⁶ CD³⁴⁺–клеток/кг массы тела. Однако почти 11-летнее наблюдение дало обескураживающие результаты: у четырех пациентов в течение 31–68 мес. развился острый Т-клеточный лейкоз, и один из них умер [25, 26]. Причиной развития острого лейкоза стали интеграция ретровирусного вектора вблизи нескольких протоонкогенов и перестройка генома клеток-мишеней, приведшие к многокаскадной активации протоонкогенов и, как следствие, неконтролируемой пролиферации Т-клеток (рис. 9).

Наиболее часто вовлекаемый в онкогенез ген LMO2 (LIM domain-only 2) локализован у человека на 11-й хромосоме. Он экспрессируется в ядре клетки и действует как транскрипционный активатор факторов, необходимых для дифференциации эритроцитов в костном мозге. В норме ген LMO2 экспрессируется в различных тканях, таких как почки, печень, легкие, селезенка и ЦНС, участвует в ангиогенезе. Однако его активизация в Т-клетках в результате встраивания ретровируса или хромосомной транслокации приводит их к неконтролируемому размножению и развитию острого Т-клеточного лейкоза. Химиотерапия оказалась успешной у трех пациентов с развившимся лейкозом. Она позволила добиться восстановления поликлональных трансдуцированных T-клеточных популяций [24, 37, 57].

S.E. Raper et al. [46] описали случай летального исхода при лечении пациентов с врожденным дефицитом орнитинтранс-карбамилазы (ornithine transcarbamylase, OTC). Мужчине 18 лет, участвовавшему в пилотном проекте по оценке безопасности нового метода генной терапии, была введена векторная наноконструкция на основе человеческого аденовируса 5-го типа с делетированными генами E1 (необходим для репликации вируса) и E4 (участвует в регуляции транскрипции вирусной ДНК), включающая клонированную кДНК гена OTC человека. Пациенту было введено через правую печеночную артерию 6 • 10¹¹ векторных частиц/кг. Приблизительно через 18 ч были замечены изменения в его психике и развитие желтухи, чего не наблюдалось у первых 17 пациентов, участвовавших в этом же исследовании. В дальнейшем у пациента развились диссеминированная внутрисосудистая коагуляция (disseminated intravascular coagulation), синдром системного воспалительного ответа (systemic inflammatory response syndrome) и множественная органная недостаточность, приведшие к смерти через 98 ч после введения аденовирусного вектора. При посмертном исследовании вектор с клонированным геном обнаружен почти во всех тканях погибшего пациента. Причины его смерти авторами не объяснены. Ими только сделан вывод, что такие способы лечения нуждаются в значительно большем количестве опытов на животных, чем было проведено, и изучении возможных иммунных ответов у пациента.

Распознавание поражения людей нанообъектами

Самым трудным в распознавании таких поражений будет определение случая поражения, т.е. формирование стандартного клинического, патологоанатомического и патоморфологического описания случая болезни, вызванного определенным типом нанообъекта. Сделать предположение о поражении нанообъектами (среди других причин) отдельных лиц или групп населения можно на основе сопоставления их анамнеза и клинических проявлений поражения. Например, развитие однотипных онкологических процессов у объединенных общей идеей (врагом) политических деятелей или развитие медленнопрогрессирующей легочной патологии у рабочих, занятых на одном производстве. Однако для установления фактора нанообъекта в развитии патологии пациента необходимо:

1) для наночастиц известных веществ, полученных дезагрегированием или конденсацией, — обнаружение этих наночастиц в пораженных тканях;

2) для доставленных в клетки-мишени векторных конструкций — обнаружение векторных молекул вместе с трансгенами и с соответствующими регионами транскрипции и инициации мРНК.

Первый подход хорошо иллюстрируется приведенным выше описанием группового поражения людей наночастицами двуокиси кремния, при котором в установлении связи между патоморфологией и наличием наночастиц основную роль сыграла трансмиссионная электронная микроскопия, а в определении химической природы наночастиц — метод EDX. Второй подход иллюстрирован примерами с поражениями людей векторными конструкциями на основе ретровируса мышиной лейкемии Молони и человеческого аденовируса 5-го типа. И в том и в другом случае в тканях-мишенях жертв этих экспериментов были обнаружены векторные конструкции с клонированными в них трансгенами и регуляторными элементами. Случай с развитием острого лейкоза у детей очень показателен для разработки подходов к выявлению таких поражений. Для гена LMO2 ранее уже было показано участие в развитии острого лейкоза, когда в основе механизма его активизации в Т-клетках лежат спонтанные перестройки (транслокации) хромосомы 11. Однако в случае искусственно вызванной у детей лейкемии было обнаружено, что этот ген в Т-клетках находится под контролем LTR³ вируса мышиной лейкемии Молони, в геноме человека никогда ранее не встречавшегося.

В/б — внутрибрюшинное введение

ВИЧ — вирус иммунодефицита человека

ВЭЛ — вирус энцефалита лошадей

ГЭБ — гематоэнцефалический барьер

И/т — интратрахеальное введение

кДа — килодальтон

мкм — микрон

нм — нанометр

ПЭГ — полиэтиленгликоль

РЭС — ретикулоэндотелиальная система

СОЭ — скорость оседания эритроцитов

т.п.о. — тысяча пар оснований

ЦНС — центральная нервная система

ALT (alanine aminotransferase) — аланинаминотрансфераза

AST (aspartate aminotransferase) — аспартатаминотрансфераза

CAEV (caprine arthritis-encephalitis virus) — вирус артрита-энцефалита коз

EDX (energy-dispersive X-ray spectroscopy) — метод энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии

EIAV (infectious anemia virus) — вирус инфекционной анемии лошадей

FIV (feline immunodeficiency virus) — вирус иммунодефицита кошачьих

HSV (herpes simplex virus) — вирус герпеса простого

JDV (jembrana disease virus) — вирус болезни Джембрана (лентивирус, вызывающий иммунодефицит у крупного рогатого скота)

LTR (viral long terminal repeat) — вирусный длинный терминальный повтор

MLV (moloney murine leukemia virus) — вирус мышиной лейкемии Молони

MVV (Мaedi-Visna virus) — вирус Висна — Маэди

MWCNT (multiwall carbon nanotube) — мультистеночные углеродные нанотрубки

PEI (polyethylene imine) — полиэтиленимин

SWCNT (single-wall carbon nanotube) — одностеночные углеродные нанотрубки

VATS (video-assisted thoracic surgery) — оперативное вмешательство на грудной клетке под видеонаблюдением

Для сбора данных об обстоятельствах, приведших к поражению нанообъектами, и масштабах поражения проводится анализ научной литературы на предмет описания сходных случаев и выстраиваются аналогии. Также анализируются истории болезни в стационарах и поликлиниках, поднимаются протоколы патологоанатомических вскрытий, собираются и исследуются соответствующими методами образцы тканей пациентов, подпадающих под описание данного случая поражения нанообъектами. Проводятся опросы (анкетирование) установленных пораженных и их лечащих врачей; выполняются медицинские осмотры лиц, находившихся на территории, где произошло поражение, или взаимодействующих с факторами, которые могут привести к такому поражению, но пока не имеющих клинических признаков болезни.

***

Нанообъекты представляют собой новую биологическую угрозу с трудно прогнозируемым поражающим потенциалом. Они способны вызывать массовые смертельные поражения людей, проявляющиеся клиникой болезни, неизвестной врачам, либо она может маскироваться под уже известные описания, однако иметь совершенно иную этиологию, чем та, что традиционно рассматривается врачами при выборе способов лечения пациентов. Среди наночастиц известных веществ, полученных путем их дезагрегирования или конденсирования, наибольшую опасность представляют объекты, имеющие размер менее 50 нм; формирующие инкапсулирующие структуры; и подвергнутые биофункционализации. Среди искусственно созданных наноконструкций, способных переносить генетическую информацию, наибольшую опасность для здоровья людей представляют наноструктуры на основе ретровирусных векторов и искусственные векторные системы. Уже сегодня в рамках технологий их создания возможно получение нанообъектов, обладающих способностью проникать в любые клетки-мишени и распространяться любым способом, включая ингаляционный, и даже парентерально, через массовую вакцинацию.