Газета «Новости медицины и фармации» 3 (608) 2017
Вернуться к номеру
Использование микрофлюидной технологии в исследовании системы гемостаза
Авторы: Мельник А.А.
к.б.н., руководитель проекта специализированного медицинского центра «Оптима-фарм», г. Киев, Украина
Разделы: Справочник специалиста
Версия для печати
Согласно данным Центра по контролю и профилактике заболеваний США (Centers for Disease Control and Prevention) ежегодно в мире на лабораторную диагностику расходуется более 100 млрд долларов. Это обусловлено тем, что лабораторные методы предоставляют врачам-клиницистам около 80 % всей диагностической информации. Если в 1970 г. лабораторная диагностика имела в своем арсенале 81 лабораторный тест, в 2000 г. — уже 170, то к настоящему времени количество диагностических тестов приближается к 1000 аналитам. Лабораторная диагностика, являясь самостоятельной дисциплиной, за последнее десятилетие накопила огромное количество теоретических и практических знаний о молекулярных механизмах многих процессов, происходящих в живом организме. В связи с этим уделяется большое внимание развитию новых информативных лабораторных методов диагностики. Одним из таких инновационных методов является микрофлюидная технология.
Микрофлюидная технология
В конце 80-х гг. XX века проф. A. Manz предложил концепцию создания аналитических систем на микрочиповой платформе или микрофлюидных чипах (МФЧ) [1]. Эти системы представляют собой синтез микрофлюидных аналитических систем и интегральных схем. Они получили название lab-on-a-chip («лаборатория на чипе») или mTAS — micro Total Analysis Systems («миниатюризованные системы полного анализа»). Термины lab-on-a-chip и mTAS являются синонимами. В МФЧ основные стадии анализа (загрузка, транспортировка пробы и реагентов, фильтрация и концентрирование пробы, химические реакции, разделение продуктов, детектирование аналита и т.д.) можно реализовать на одной компактной подложке. МФЧ востребованы как современный аналитический инструмент в научных исследованиях, биотехнологии, медицине, криминалистике, экологии и т.д. [2–4]. Одним из первых аналитических методов, реализованных на МФЧ, был метод капиллярного электрофореза [5]. В настоящее время наиболее развиты электрофоретические и электрохроматографические методы разделения пробы на МФЧ, которые применяются для экспресс-анализа ДНК и РНК, сиквенса ДНК [6], анализа белков [7], неорганических и органических веществ [8], иммунного анализа [9]. Создаются интегрированные микрофлюидные системы, в которых совмещены сразу несколько функциональных устройств и модулей. К основным преимуществам mTAS относятся мобильность, износостойкость, высокая чувствительность, снижение расходов реагентов на тест, низкое энергопотребление, короткое время получения результатов, меньшее пространство в лаборатории, дешевое серийное производство, управляемая диффузия, высокоскоростная последовательная обработка результатов.
Микрофлюидные устройства для мониторинга гемостаза
Чтобы избежать серьезных осложнений, связанных с кровотечением или тромбозом, для многих клинических ситуаций, таких как хирургическое вмешательство, травма, сепсис, применение антикоагулянтной и антитромбоцитарной терапии, необходим быстрый и точный мониторинг системы гемостаза [10–12]. Во всем мире увеличивается количество пациентов, при лечении которых применяют экстракорпоральные вспомогательные устройства (гемодиализ, мембранная оксигенация, механическая поддержка кровообращения и др.), требующие точного и персонализированного антикоагулянтного мониторинга в режиме реального времени с возможностью сохранения гемостаза в естественных условиях с целью предотвращения образования сгустков на пути транспорта крови [13, 14]. Большинство из этих устройств не способно точно и непрерывно осуществлять дозирование антикоагулянта, что часто служит причиной катастрофического кровотечения и смерти [15]. Кроме того, главным требованием для проведения мониторинга гемостаза у постели больного является использование небольшого объема крови, что является особенно критичным у детей с острой коагулопатией (приобретенной или врожденной), так как дети являются более уязвимыми, чем взрослые [16–18].
В течение последних нескольких лет были разработаны различные тесты и анализаторы для оценки свертывания крови и определения функции тромбоцитов in vitro (в пробирке). Эти тесты включают такие показатели, как время кровотечения, активированное время свертывания, активированное частичное тромбопластиновое время, протромбиновое время, тромбоэластографию, агрегометрию тромбоцитов и многое другое. Несмотря на то, что применение данных тестов обеспечивает предоставление полезной информации о состоянии коагуляционного статуса или функции тромбоцитов, они имеют существенные ограничения с точки зрения их способности предсказывать тромбоз или риск кровотечения в различных клинических случаях. Это связано с тем, что эти тесты не могут включать многих из ключевых участников для контроля гемостаза, которые функционируют in vivo (в естественных условиях). Главный недостаток данных тестов заключается в измерении свертывания крови статически (не в потоке) или не в соответствии с условиями потока крови. При этом не учитывается влияние гемодинамической силы (давление, текучесть, напряжение сдвига) и связанное с ним клеточное взаимодействие, которое, как известно, значительно влияет на образование тромбов в сосудах [19]. Было показано, что инициация агрегации тромбоцитов при артериальном тромбозе in vivo и свертывание в экстракорпоральных устройствах обычно происходят в местах резких возмущений потока, точках застоя крови и стенозных участках [20, 21]. Однако ни один из рутинных тестов для исследования гемостаза не учитывает эти физиологические условия для оценки свертывания крови.
На основании научных исследований для этой цели были разработаны микрофлюидные устройства с камерами параллельного потока, которые имитируют атеросклероз сосудов и воссоздают физиологическую скорость сдвига и градиенты с использованием цельной крови человека в комбинации с внеклеточным матриксом (коллагеном), покрывающим поверхность [22, 23]. Эти исследования подтвердили, что гемостаз индуцируется при контакте крови с матрицей в зависимости от скорости локального потока. К сожалению, основные идеи, выдвинутые в этих исследованиях, не были внедрены в клиническую практику в основном по причине того, что такие устройства не предназначены для использования у постели больного и требуют высокоспециализированных приборов и обработки изображений [24–27].
В работе А. Jain et al. [28] описано простое микрофлюидное устройство для мониторинга гемостаза и функции тромбоцитов в режиме реального времени, которое позволяет быстро определить время свертывания нативной цельной крови путем перфузии через сеть каналов и имитирует локальные физиологически значимые изменения в гемодинамическом потоке при стенозе артерий. Главной основой в разработке этого микрофлюидного устройства является то, что каналы включают многочисленные области престеноза и постстеноза, что, в свою очередь, генерирует патофизиологический сдвиг скорости и градиента, которые действуют как гемодинамические активаторы в случае свертывания крови внутри устройства. Для точной оценки образования сгустка в автоматическом режиме производится изменение давления жидкости в случае увеличения окклюзии канала, что отслеживается устройством в режиме реального времени, а физиологическое «микрофлюидное» время свертывания выводится на экран монитора в виде количественной конечной точки с использованием новой математической модели. Такое устройство может быть напрямую интегрировано в сосуд и способно производить мониторинг гемостаза нативной крови в режиме реального времени.
Мониторинг гемостаза с использованием микроустройства
При перфузии цельной крови через микрофлюидное устройство, содержащее микроканалы, имитируется стеноз артерий (например, сужение из-за атеросклеротических бляшек). Это осуществляется при создании внезапного ускорения жидкости (область престеноза), далее — однородного ее сдвига (область стеноза) и затем — внезапного ее замедления (область постстеноза) (рис. 1).
Вначале исследуемая цельная кровь вводится в специальный резервуар, а затем разделяется на 12 маленьких параллельных каналов (ширина — 200 мкм, высота — 75 мкм) с последующей сходимостью потока в выходном отверстии. Общая ширина и длина устройства разработаны таким образом, чтобы соответствовать стандартному стеклянному слайду для проведения микроскопии изображения в режиме реального времени с использованием объектива с низким увеличением (рис. 2).
/22_m.jpg)
Каждый канал содержит несколько секций под углом 60° и прямые участки для достижения максимально возможной области поверхностного контакта в процессе образования сгустка (производится три параллельных измерения на стеклянном слайде устройства) (рис. 3).
Неньютоновский компьютерный анализ крови, протекающей через устройство, подтверждает, что скорость сдвига быстро меняется при престенозе и постстенозе на расстоянии 300 мкм и остается в основном однородной на прямом участке (рис. 4).
/23_m.jpg)
Существует линейная зависимость между скоростью сдвига (У) на прямом участке (определяется скоростью потока) и максимальным градиентом скорости сдвига (У*). При этом ускорение потока и его торможение зависят друг от друга — У* ~ 3,5У. На основе этого рассчитывается разность сдвига стенозированной области. Установлено, что эта разность соответствует изменениям, эквивалентным тем, которые получают, когда диаметр артериол уменьшается с 275 до 125 мкм или соответствует 55 % стеноза, что характерно для пациентов с атеросклерозом (рис. 5).
/23_m2.jpg)
Микрофлюидный анализ времени свертывания крови
Для оценки возможности практического применения микрофлюидных систем в конкретных клинических ситуациях было проведено измерение времени свертывания на основе регрессионной модели. С этой целью прежде всего исследовали чувствительность гепарина в диапазоне концентраций от 0 до 1 МЕ/мл. Обнаружено, что время свертывания крови линейно возрастало по мере повышения концентрации гепарина от 0 до 1 МЕ/мл как при низком (1,225 с–1 • мм–1), так и при высоком (4,375 с–1 • мм–1) уровнях сдвига градиента (рис. 6).
/23_m3.jpg)
Эти показатели подтверждают, что данное устройство может быть использовано для надежной терапии гепарином в клинических условиях in vitro.
Быстрый тест определения функции тромбоцитов при стенозированном потоке in vitro
Доказано, что агрегация тромбоцитов вносит основной вклад в развитие сосудистой окклюзии, поэтому данное устройство использовали для определения функции агрегации тромбоцитов при стенозированном потоке [29]. Это имеет ряд преимуществ. Во-первых, для проведения исследования, которое составляет всего несколько минут, требуется небольшой объем цельной крови (< 1 мл). Во-вторых, при покрытии микроканалов коллагеном, который, как известно, является агонистом тромбоцитов, наблюдается большое количество фибрина и агрегированных тромбоцитов в постстенозных областях. Это согласуется с тем, что градиент скорости сдвига в области замедления потока может вносить главный вклад в гемостатический ответ (рис. 7).
/23_m4.jpg)
Мониторинг антиагрегантной терапии
При введении абциксимаба (ReoPro®) в образцы крови здоровых индивидуумов в клинической дозе (повышенная доза от 0,5 до 20 мкг/мл) наблюдали дозозависимый эффект микрофлюидного времени свертывания. Увеличение времени свертывания было зафиксировано также у пациентов, которые проходили лечение двойной антиагрегантной терапией (аспирин и клопидогрель), по сравнению со здоровыми пациентами.
Синдром Германского — Пудлака
Данное устройство с коллагеновым покрытием применили для изучения образцов крови у пациентов с синдромом Германского — Пудлака. Это редкое заболевание, при котором происходит кровотечение из-за недостатка плотных гранул в тромбоцитах. Важно отметить, что при использовании традиционного метода агрегации тромбоцитов, а именно анализатора PFA-100, не было обнаружено дефекта тромбоцитов у пациентов с синдромом Германского — Пудлака. Когда же в устройство была перфузирована кровь двух пациентов с синдромом Германского — Пудлака, то не наблюдалось образования сгустка при применении высокого градиента скорости сдвига (8,750 с–1 • мм–1). Это показывает, что сдвиг активированного градиента является высокочувствительным при определении дефектов тромбоцитов у пациентов с синдромом Германского — Пудлака и может эффективно использоваться для диагностики этого заболевания.
Все эти данные доказывают правильность концепции анализа времени свертывания, которая заключается в том, что микрофлюидное устройство является чувствительным при адгезии тромбоцитов к коллагену и модулирует активацию тромбоцитов, мишенью которых являются рецепторы P2Y12, αIIbβ3, циклооксигеназный путь.
Выводы
Биометрическое устройство для мониторинга гемостаза обладает несколькими потенциальными преимуществами по сравнению с другими аналитическими системами.
1.
Благодаря наличию полного кровотока и стенозированной скорости сдвига в устройстве образование сгустков происходит при практически физиологических условиях и включает комплексную реологию крови, что имеет решающее значение для тромбоза. Хотя устройство изготовлено для создания фиксированного 55% стеноза в каждом канале и не может изменяться (как это происходит в условиях in vivo), тем не менее имеется возможность применить скорость градиента сдвига для имитации у каждого конкретного пациента в завимости от его состояния. Например, при анализе крови пациентов с атеросклерозом, которые имеют более высокую степень стеноза, документированную клинически, это можно осуществить с помощью более высоких градиентов сдвига, которые лучше соответствуют тяжести заболевания.
2.
Образование сгустка может быть зафиксировано количественно в режиме реального времени с использованием помпы, сенсорного датчика давления и монитора, которые составляют часть устройств, применяющихся в экстракорпоральных системах и широко используемых в настоящее время в медицинской практике [30, 31].
3.
Одним из важных преимуществ устройства является использование параллельных стенозных каналов. Многочисленные каналы лучше имитируют свертывание в естественных сосудах, чем один очень длинный канал. Применение многочисленных параллельных каналов в сочетании с математической обработкой данных позволяет их использовать как цифровой фильтр. Это способствует преодолению сложностей при расшифровке ответа, которые могут возникать в единичных каналах (например, прохождение дебриса, пузырьков воздуха или других локальных возмущений).
4.
Устройство позволяет эффективно мониторировать функцию тромбоцитов в цельной крови при анализе риска кровоточений у труднодиагностируемых пациентов. Являясь глобальным тестом мониторинга гемостаза, это устройство предполагает анализ потенциальных комплексных коагулопатий, таких как сепсис и серповидноклеточная анемия, при которых бактерии и серповидные эритроциты способствуют изменениям в системе гемостаза.
5.
Это устройство может быть функционально интегрировано в экстракорпоральные медицинские изделия, что обеспечит более простой и надежный способ мониторинга коагулопатий и анализ проявления действия антитромботической терапии в течение долгого времени в отделениях реанимации, интенсивной терапии или у постели больного.
Таким образом, микрофлюидное устройство для исследования гемостаза является новым удобным методом для глобального анализа функции тромбоцитов, мониторинга антитромбоцитарной терапии и оценки пациентов с нарушениями свертываемости крови.
Список литературы
Список литературы находится в редакции