Газета «Новости медицины и фармации» №14 (674), 2018
Вернуться к номеру
Система «теломеры — теломераза» как молекулярно-генетический индикатор старения у человека
Авторы: Мельник А.А.
к.б.н., руководитель проекта специализированного медицинского центра «Оптима-фарм», г. Киев, Украина
Разделы: Справочник специалиста
Версия для печати
Достижения медицинской науки за последние 100 лет почти удвоили продолжительность жизни населения в развитых странах. Так, ожидаемая продолжительность жизни в 2015 г. составляла 71,4 года (73,8 года для женщин и 69,1 года для мужчин). В период между 2000 и 2015 гг. средняя продолжительность жизни увеличилась на 5 лет, что является самым быстрым ростом с 1960-х годов. По статистическим оценкам, этот бум долголетия приведет к тому, что к 2025 году численность популяции людей в возрасте старше 60 лет достигнет 1,2 миллиарда. Резкое постарение населения во всем мире и развитие хронических заболеваний с возрастом приводят к большому вложению средств в программы лечения пожилых людей [1]. Для повышения качества жизни людей при снижении реальных темпов старения и увеличении продолжительности активной трудоспособной жизни необходима разработка точных количественных методов диагностики процессов, связанных со старением. Поэтому для поддержания здоровья и благополучия этой растущей прослойки населения обязательным условием является понимание молекулярных механизмов и биологических процессов, лежащих в основе старения и ассоциированных с ним заболеваний.
Старение представляет собой процесс, вызываемый комплексом регуляторных факторов, и является генетически детерминированным. Существуют различные подходы к оценке биологического возраста [2]. Задача определения биологического возраста состоит в том, чтобы на основании известных для данной популяции зависимостей между специфическими биомаркерами и хронологическим возрастом по индивидуальным значениям этих показателей у человека вычислить его биологический возраст. Для этого предложены различные тесты (около 600), которые могут служить индикаторами старения именно человека. Пока не удается однозначно ответить на вопрос, какое число показателей оптимально для определения биологического возраста.
В настоящее время существуют две основные теории механизмов старения — теломерная и окислительная (свободнорадикальная или митохондриальная). Тем не менее появляется все больше доказательств того, что центральная роль в возрастной дегенерации тканей и уменьшении резервов стволовых клеток принадлежит именно теломерам. Ряд исследователей считают теломерную теорию наиболее убедительной.
Теломеры
В 1938 г. американский генетик Hermann J. Müller, работая в Эдинбургском институте генетики животных (Соединенное Королевство), проводил опыты с мухами вида Drosophila melanogaster, подвергая их воздействию рентгеновских лучей [3]. Он заметил, что концы облученных хромосом в отличие от других генов не претерпевают изменений в виде делеции или инверсии благодаря наличию защитного «колпачка», который он назвал «защитный ген», а позже — «теломера» от греч. telos («конец») и meros («часть») (рис. 1).
Два года спустя исследователь из Миссурийского университета (США) Barbara McClintock [4], работа которой была посвящена изучению генетики кукурузы (Zea mays), обнаружила, что разрыв хромосом приводит к адгезии и слиянию их концов с последующим образованием дицентрических хромосом. Независимо от повреждения, концы могут быть восстановлены благодаря новой теломере. Согласно ее выводам, теломеры играют решающую роль в целостности хромосом, поскольку они предотвращают появление циклов «разрыв — слияние — мост», которые катастрофичны для выживаемости клеток.
В 1961 г. L. Hayflick, профессор анатомии Калифорнийского университета (США), и P. Moorhcad [5] представили данные о том, что даже в идеальных условиях культивирования фибробласты эмбриона человека способны делиться только ограниченное число раз (50 ± 10), после чего их способность к пролиферации исчерпывается. Данное свойство получило название «клеточное старение» («предел Хайфлика»), наследуется генетически и не зависит от условий культивирования клеток (рис. 2).
В 1971 г. Алексей Оловников [7, 8] на основании оригинальных работ J. Watson [6] предложил теорию маргинотомии (отсчета клеточных делений и старения), которая объясняла механизм работы теломер. При матричном синтезе полинуклеотидов ДНК-полимераза не в состоянии полностью воспроизвести линейную матрицу и реплика получается всегда короче в ее начальной части. Таким образом, при каждом делении ДНК клетки укорачивается, что ограничивает пролиферативный потенциал клеток и является «счетчиком» количества делений и, соответственно, продолжительности жизни клетки. При каждой репликации хромосом теломеры укорачиваются, т.е. дочерняя ДНК оказывается несколько короче материнской (рис. 3).
/12_m.jpg)
Теломеры
Теломеры человека — это нуклеопротеидные концевые участки хромосом, содержащие от 4 до 14 тысяч высококонсервативных пар оснований и состоящие из повторов TTAGGG. Длина TTAGGG участков варьирует от вида к виду. Так, теломеры человека имеют размер 4–14 kbр (килобазная пара представляет собой единицу длины нуклеиновых кислот, равную 1000 пар оснований), в то время как лабораторные мыши имеют теломеры более длинные — 36–150 kbр. Теломера заканчивается однонитевым нависающим 3’-концом, завернутым в структуру, называемую Т-петлей, которая не позволяет концам хромосом соединяться друг с другом. При этом однонитевый конец теломеры проникает в прилегающий к Т-петле двунитевый участок, образуя D-петлю (displacement loop), закрепляющую T-петлю. Функции теломер зависят от минимальной длины теломерных повторов и активности связанного с ними белкового комплекса. Этот комплекс называется шелтерином и состоит из шести белков [9, 10] (рис. 4):
/13_m.jpg)
1. TIN2 (TRF1-interacted nuclear protein 2) — препятствует присоединению теломеразы к теломере.
2. TPP1 (Telomere protected protein 1) — образуя гетеродимер с POT1, присоединяется к однонитевой теломерной ДНК, защищая ее от повреждений.
3. POT1 (Protection of telomeres) — защищает G-богатую нависающую нить ДНК, располагаясь в олигонуклеотид-/олигосахаридсвязующем сгибе в теломерах, препятствует слиянию теломер конец в конец.
4. TRF2 (Telomere repear binding factor 2) — поддерживает целостность теломер, защищая от слияния друг с другом.
5. TRF1 (Telomere repeat binding factor 1) — отрицательный регулятор длины теломер, не допускающий теломеразу к теломере.
6. RAP1 (Rif-associated protein) — с С-концом этого белка связываются белки RIF1 и RIF2 (Relaxing insulin-like factors), препятствующие работе теломеразы. Он удерживает Т-петлю, образуя поперечные сшивки с теломерной ДНК.
Функции теломер:
– сохранение целостности генома;
– облегчение гомологичной рекомбинации при мейозе;
– участие в архитектонике клеточного ядра;
– регуляция экспрессии генов (эффект положения гена);
– определение репликативного потенциала клетки.
Хромосомы, лишенные теломер из-за разрывов, подвергаются слиянию, деградации и перестают выполнять свои функции.
Причины и следствия дисфункции теломер представлены в табл. 1.
/13_m2.jpg)
Теломераза
В конце 1980-х годов теорию А. Оловникова подтвердили исследователи из США Elizabeth H. Blackburn, Jack W. Szostak и Carol W. Greider (Нобелевская премия 2009 г. с формулировкой «за открытие механизмов защиты хромосом теломерами и ферментом теломеразой»). Им удалось выяснить механизм, благодаря которому хромосомы копируются во время деления клетки, и то, каким образом они защищены от деградации. Учеными было обнаружено, что чем короче теломеры, тем старее клетка, и наоборот, если активность теломеразы, достраивающей теломеры, высокая и постоянно поддерживается одинаковая длина теломеры, клетка не стареет.
Теломераза — это большой рибонуклеопротеиновый комплекс, ответственный за синтез ДНК-повторов теломеры (TTAGGG) на 3’-концах линейных хромосом, что предотвращает потерю ДНК при каждой репликации. Теломераза представляет собой обратную транскриптазу, которая состоит из каталитической белковой субъединицы, называемой обратной транскриптазой теломеразы (TERT), кодируемой геном hTERT, которая расположена на хромосоме 5p15.33, РНК-компонента, известного как теломераза РНК человека, или теломеразный РНК-компонент человека (TERC), кодируемого геном hTERC на хромосоме 3q26, и дискерина (кодируется геном DKC1). TERT содержит 1131 аминокислоту и имеет м.в. > 100 кД. По своей структуре напоминает форму рукавицы, которая позволяет ему прикрепляться к хромосоме и добавлять в нее участки теломер, состоящие из одной цепочки. TERT захватывает TERC (имеющую длину 451 нуклеотид), которая не транслируется [11] (рис. 5).
/13_m3.jpg)
Теломераза имеет полимеразную активность, при этом она строит цепь ДНК комплементарно своей собственной определенной РНК-матрице. Данная РНК-матрица, как и вся РНК в клетке, транскрибируется со своего гена, претерпевает изменения, созревает, узнается теломеразой и образует с ней комплекс. Этот комплекс узнает теломерные участки ДНК и удлиняет 3’-конец ДНК на 8 нуклеотидов, комплементарных РНК-матрице. Затем она пересаживается на только что синтезированный 3’-конец и удлиняет его снова. Таких удлинений может быть много. Поэтому теломерные участки состоят из множественных повторов. После этого на удлиненную цепь отжигается праймер и ДНК-полимераза комплементарно достраивает короткую цепь ДНК (рис. 6).
При матричном синтезе полинуклеотидов теломераза не в состоянии полностью воспроизвести линейную матрицу, реплика получается всегда короче в ее начальной части. Поэтому после определенного количества делений клетка больше делиться не может. Этот феномен получил название «концевая недорепликация ДНК». Из этого следует важный вывод: возраст человека связан с длиной теломер. Чем старше человек, тем меньше средняя длина его теломер. У человека длина теломер варьирует от 15 тысяч нуклеотидных пар (т.н.п.) при рождении до 5 т.н.п. при хронических заболеваниях. Максимальная длина теломер — у 18-месячных детей, а затем она быстро снижается до 12 т.н.п. к 5-летнему возрасту. После этого скорость укорачивания снижается.
Метод измерения теломер
/14_m.jpg)
Длина теломер клеток человека, в частности лейкоцитов, наиболее часто используется в качестве биомаркера старения [12, 13]. Для измерения длины теломер применяется метод FISH (Fluorescence In Situ Hybridization), или флюоресценция на месте гибридизации. Это цитогенетический метод, используемый для детекции и локализации специфических последовательностей ДНК на хромосомах, мРНК и др. В основе методики лежит гибридизация флуоресцентно меченого ДНК/РНК зонда с комплементарной последовательностью ДНК/РНК. Выявление метки происходит с помощью флуоресцентного микроскопа. Одним из вариантов FISH является Q-FISH (Quantitative FISH), разработанный U. Lansdorp и др. [14]. Q-FISH — это количественный метод, который применяется для работы с проточной цитометрией. Изначально использовался для измерения длины хромосом (разрешение — 200 bp) путем подсчета числа теломерных повторов. На данный момент Q-FISH является важным инструментом в изучении роли теломер в процессах старения.
Используя метод Q-FISH и проточную цитометрию, можно измерить общее количество флуоресценции в клетке, чтобы оценить среднюю длину теломер в хромосомах. На рис. 7 представлен результат FISH (клетки крови 5-летнего ребенка и 90-летнего человека). Каждая точка представляет собой одну клетку. Для внутреннего контроля включены клетки с длинными теломерами коровы (правый нижний угол). На рис. 7 видно, что средняя длина теломер в клетках 5-летнего ребенка больше, чем в клетках 90-летнего человека.
Данные об изменении средней длины теломер в лимфоцитах и гранулоцитах в большой группе индивидуумов в зависимости от возраста представлены на рис. 8.
Наиболее быстрое снижение длины теломер происходит в течение первых нескольких лет жизни, но продолжается до конца полового созревания. У взрослых скорость укорочения теломер замедляется. Это более заметно в гранулоцитах, что отражает деление клеток в кроветворных стволовых клетках по сравнению с лимфоцитами.
Теломеразная теория старения
Факт о том, что теломеры человека укорачиваются с возрастом, стал известным более 20 лет назад. Люди с короткими теломерами входят в группу риска преждевременной смертности. R. Cawthon и др. [15] продемонстрировали, что для 25 % 60-летних участников исследования, имевших наиболее длинные теломеры, был характерен в 2 раза более низкий риск смерти, чем для 25 % участников с наиболее короткими теломерами. R. Cawthon имел доступ к уникальной базе данных, содержащей законсервированные образцы крови 20-летней давности. В течение многих лет (с момента появления данных Cawthon R.) никому не удалось ни воспроизвести, ни опровергнуть эти результаты.
/14_m2.jpg)
Исследования молекулярных механизмов старения осложняются тем фактом, что старение не является уникальным клеточным процессом. Механизмы старения существенно отличаются у клеток, полученных из различных видов животных.
Мутации в генах, кодирующих фермент теломеразу, включая TERT, TERC и DKCI, приводят к таким заболеваниям, как врожденный дискератоз, апластическая анемия, легочный фиброз, цирроз печени, остеопороз, опухоли. При этих мутациях теломеразы происходит сборка дисфункционального теломеразного комплекса, который сохраняет частичную активность, или каталитическая активность фермента утрачивается полностью. Обычно только одна аллель теломеразного гена отвечает за неактивность теломеразно-ферментативного комплекса. Инактивация теломеразы приводит к мутациям в генах. Клинические проявления при недостаточности теломеразы могут быть различной природы. Недостаточность теломеразы не является причиной патологии, но отражается на поддержании гомеостаза теломер.
Ограничения теломеразной теории старения
В настоящее время проводятся исследования связи длины теломер и старения человека [16]. Однако уже сейчас по результатам этих работ можно сделать заключение о том, что длина теломер и скорость их укорочения сильно варьируют в популяции. Предполагается, что длина теломер выступает в качестве надежного биомаркера старения не на всех, а только на определенных стадиях жизни [17]. Остается открытым вопрос, является ли длина теломер показателем нормального процесса старения или только маркером заболеваний, связанных со старением [18]. Из-за недостаточности знаний о процессе старения до сих пор трудно отличить непосредственно старение от заболеваний, связанных с его процессами [19, 20]. Кроме того, пока отсутствуют научные работы о вероятном влиянии предшествующих заболеваний, например таких, как эффект вирусных инфекций на длину теломер, и нужно ли это рассматривать в качестве потенциальных факторов, которые будут влиять на оценку результатов. Возможно, что длину теломеры можно считать биомаркером старения только на определенных этапах жизни [21].
Связь длины теломер и некоторых заболеваний
1. Сердечно-сосудистые заболевания
У пациентов с более короткими лейкоцитарными теломерами в 3 раза чаще наблюдалась смертность от сердечно-сосудистых заболеваний и в 8,5 раза — от инфекционных заболеваний [15]. В исследовании S. Brouilette и др. [22] было показано, что у молодых людей с более короткими теломерами риск развития преждевременного инфаркта миокарда был увеличен в 2,8–3,2 раза [22]. Сердечно-сосудистый риск в зависимости от длины теломер наблюдали у пожилых людей [23]. Длина теломер лейкоцитов периферической крови имеет прогностическое значение в качестве теста при развитии сердечно-сосудистых заболеваний [24].
2. Хронический стресс
Для людей, живущих в условиях хронического стресса, характерны меньшая продолжительность жизни и раннее развитие возрастных болезней. Причиной стремительного укорочения теломер в данном случае может быть активация вегетативной нервной и нейроэндокринной систем с последующим выбросом глюкокортикоидных гормонов.
3. Наследственные дегенеративные заболевания
Результаты изучения особенностей хромосом пациентов с наследственными дегенеративными заболеваниями, характеризующимися преждевременным старением организма, в том числе аутосомно-доминантным врожденным дискератозом (синдромом Цинссера — Энгмена — Коула), прогерией взрослых (синдромом Вернера) и атаксией-телеангиэктазией (синдромом Луи-Бар), указывают на важную роль, принадлежащую теломерам в процессах старения.
4. Приобретенные дегенеративные заболевания
Существуют доказательства роли теломер в развитии приобретенных дегенеративных заболеваний. Наиболее показательным примером является цирроз печени, при котором значительное повышение скорости обновления гепатоцитов сопровождается прогрессивным укорочением теломер. В результате клетки утрачивают способность к делению и погибают, что приводит к развитию печеночной недостаточности.
5. Риск развития слабоумия и сахарный диабет
В работах L. Hong и M. Sampson [25, 26] продемонстрирована взаимосвязь между длиной теломер и риском развития слабоумия, а также сахарным диабетом.
Выводы
1. Концы линейных хромосом с 3’-конца ДНК заканчиваются повторяющимися последовательностями нуклеотидов, получивших название теломер, которые синтезируются рибонуклеиновым ферментом — теломеразой.
2. Структуры теломер одинаковы у всех позвоночных — (TTAGGG)n.
3. Укорочение теломер является ключевым фактором, запускающим развитие дегенеративных заболеваний и уменьшающим продолжительность жизни.
4. Длина теломер является прогностическим показателем риска заболеваний, их прогрессии и преждевременной смертности, а также характеристикой снижения выживаемости у пациентов с ишемической болезнью сердца и инфекционными заболеваниями.
5. Измерение активности теломеразы может обеспечить более ранний прогноз геномной стабильности и долгосрочной жизнеспособности, чем длина теломер.
6. Оценка различных аспектов состояния теломер может помочь в прогнозировании течения различных заболеваний и предоставить новые возможности для профилактических и терапевтических вмешательств, в том числе временной активации эндогенной теломеразы.
Список литературы
1. Донцов В.И., Крутько В.Н., Труханов А.И. Медицина антистарения: фундаментальные основы. — М., 2010. — 680 с.
2. Илющенко В.Г. Современные подходы к оценке биологического возраста человека // Валеология. — 2003. — № 3. — С. 11-19.
3. Muller H.J. The remaking of chromosomes // Collecting Net. — 1938. — 13. — Р. 181-198.
4. McClintock B. The stability of broken ends of chromosomes in Zea mays // Genetics. — 1941. — 26. — Р. 234-282.
5. Hayflick L., Moorhead P.S. The serial cultivation of human diploid cell strains // Exp. Cell. Res. — 1961. — 25. — Р. 585-621.
6. Watson J.D. Origin of concatemeric T7 DNA // Nat. New Biol. — 1972. — 239. — Р. 197-201.
7. Olovnikov A.M. Principle of marginotomy in template synthesis of polynucleotides // Dokl. Akad. Nauk SSSR. — 1971. — 201. — Р. 1496-1499.
8. Olovnikov A.M. A theory of marginotomy. The incomplete copying of template margin in enzymic synthesis of polynucleotides and biological significance of the phenomenon // J. Theor. Biol. — 1973. — 41. — Р. 181-190.
9. de Lange T. Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres // Genes. Dev. — 2005. — 19. — Р. 2100-2110.
10. Xin H., Liu D., Songyang Z. The telosome/shelterin complex and its functions // Genome Biology. — 2008. — 9. — Р. 232.
11. Rodrigo T. Calado, Neal S. Young. Telomere Disease // New England Journal Med. — 2009. — 361. — Р. 2353-2365.
12. Barger J.L., Walford R.L., Weindruch R. The retardation of aging by caloric restriction: its significance in the transgenic era // Exp. Gerontol. — 2003. — 38. — Р. 1343-1351.
13. Roth G.S., Ingram D.K., Lane M.A. Caloric restriction in primates and relevance to humans // Ann. NY Acad. Sci. — 2001. — 928. — Р. 305-315.
14. Lansdorp P.M., Martens U.M., Zijlmans J.M., Poon S.S., Dragowska W., Yui J., Chavez E.A., Ward R.K., Lansdorp Р.М. Short telomeres on human chromosome // Nat. Genet. — 1998. — 18. — Р. 76-80.
15. Cawthon R.M., Smith K.R., O’Brien E., Sivatchenko A., Kerber R.A. Association between telomere length in blood and mortality in people aged 60 years or older // Lancet. — 2003, Feb 1. — 361(9355). — Р. 393-5.
16. Celotti E., Ferrarini R., Zironi R., Conte L.S. Resveratrol content of some wines obtained from dried Valpolicella grapes: Recioto and Amarone // J. Chromatogr. A. — 1996. — 730. — Р. 47-52.
17. Milne J.C., Lambert P.D., Schenk S. et al. Westphal small molecule activators of SIRT1 as therapeutics for the treatment of type 2 diabetes // Nature. — 2007. — V. 29. — 450(7170). — Р. 712-716.
18. Jarolim S., Millen J., Heeren G., Laun P., Goldfarb D.S., Breitenbach M. A novel assay for replicative lifespan in Saccharomyces cerevisiae // FEMS Yeast Res. — 2004. — 5. — Р. 169-177.
19. Viswanathan M., Kim S.K., Berdichevsky A., Guarente L. A role for SIR-2.1 regulation of ER stress response genes in determining C. elegans life span // Dev. Cell. — 2005. — 9. — Р. 605-615.
20. Bass T.M., Weinkove D., Houthoofd K., Gems D., Partridge L. Effects of resveratrol on lifespan in Drosophila melanogaster and Caenorhabditis elegans // Mech. Ageing Dev. — 2007. — 128. — Р. 546-552.
21. Sun C., Zhang F., Ge X. et al. SIRT1 improves insulin sensitivity under insulin-resistant conditions by repressing PTP1B // Cell. Metab. — 2007. — 6. — Р. 307–319.
22. Brouilette S., Singh R.K., Thompson J.R., Goodall A.H., Samani N.J. White cell telomere length and risk of premature myocardial infarction // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. — 2003, May 1. — 23(5). — Р. 842-6.
23. Starr J.M., McGurn B., Harris S.E. еt al. Association between telomere length and heart disease in a narrow age cohort of older people // Experimental Gerontology. — Vol. 42, Is. 6. — P. 571-573.
24. Willeit P., Willeit J., Brandstatter A. et al. Cellular Aging Reflected by Leukocyte Telomere Length Predicts Advanced Atherosclerosis and Cardiovascular Disease Risk // Arterioscler Thromb Vasc. Biol. — 2010. — 30. — Р. 1649-1656.
25. Honig L.S., Schupf N., Lee J.N. et al. Shorter telomeres are associated with mortality in those with APOE e4 and dementia // Annals of Neurology. — 2006.
26. Sampson M.J., Winterbone M.S., Hugles J.C. et al. Monocyte Telomere Shortening and Oxidative DNA Damage in Type 2 Diabetes // Diabetes Care. — 2006. — 29. — Р. 283-289.