Журнал «Здоровье ребенка» Том 14, №2, 2019

Введение

В настоящее время бактерии Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) являются основной этиологической причиной развития внебольничной пневмонии и отитов как у детей [1, 20], так и у взрослых людей [14]. Только в Соединенных Штатах Америки ежегодно регистрируется более 500 000 случаев пневмококковой пневмонии [16]. Учитывая, что развитие заболеваний, вызванных бактериями Streptococcus pneumoniae, как и других инфекционных заболеваний, сопровождается активацией образ-распознающих рецепторов, экспрессия которых у детей, особенно раннего возраста, может быть недостаточно выражена, пневмококковые инфекции несут особый риск для состояния здоровья в периоде раннего детства [2, 3].

Пневмококковые бактерии могут формировать биопленки и колонизировать слизистые оболочки носоглотки или горла без клинических проявлений патологического процесса. Считают, что данное состояние встречается у 60 % детей [12, 17]. Формирование бактериальной биопленки защищает бактерии Streptococcus pneumoniae от действия антимикробных пептидов организма и антибактериальных препаратов. При соответствующих условиях может произойти активация патогенных бактерий, находящихся в биопленке, с последующим развитием острого инфекционно-воспалительного процесса [9, 10].

Механизмы формирования биопленки бактериями Streptococcus pneumoniae

А.Н. Маянский и соавторы [4] подчеркивают, что при формировании пневмококковой биопленки необходимо различать две фазы: раннюю, которая не зависит от системы компетентности (на этой стадии происходит адгезия бактерий к субстрату), и позднюю (после 8-часовой экспозиции), которая регулируется генами компетентности. В формировании биопленки бактериями Streptococcus pneumoniae ведущую роль играют две кворум-сенсинг-системы (quorum sensing — QS): LuxS/AI-2 и ComABCDE.

LuxS/AI-2-система

Эффекты функционирования QS-системы LuxS/AI-2 ассоциированы с действием аутоиндуктора AI-2 (autoinducer-2 — AI-2). Вместе с тем необходимо подчеркнуть, что активность системы LuxS/AI-2 в большей степени связана с каталитической способностью S-рибозилгомоцистеинлиазы (S-ribosylhomocysteine lyase — LuxS), так как аутоиндуктор AI-2 является побочным продуктом бактериального С₁-метаболизма. В процессе С₁-метаболизма происходит передача метильной группы СН₃ от S-аденозилметионина (S-adenosylmethionine — SAM) на молекулу-реципиент. В результате потери группы СН₃ SAM превращается в S-аденозилгомоцистеин (S-adenosylhomocysteine — SAH), который обладает высокой токсичностью. С целью детоксикации SAH под влиянием 5'-метилтиоаденозин/S-аденозилгомоцистеин нуклеозидазы  (5'-methylthioadenosine/S-adenosylhomocysteine nucleosidase — Pfs) превращается в аденин и S-D-рибозил-L-гомоцистеин (SRH), который в последующем при участии LuxS преобразуется в аутоиндуктор AI-2 [23]. Рецептор для AI-2 у бактерий Streptococcus pneumonia остается неидентифицированым. Основным AI-2-опосредованным эффектом является формирование бактериальной биопленки. Mukesh K. Yadav и соавторы [25] установили, что экспрессия генов, участвующих в репликации и репарации ДНК, синтезе аденозинтрифосфата (АТФ), биосинтезе капсульных компонентов, делении бактерий, трансдукции сигналов, регуляции транскрипции, компетентности, вирулентности и метаболизме углеводов, ингибирована в отсутствие сигналов, ассоциированных с системой LuxS/AI-2. Продемонстрировано, что мутантные штаммы бактерий Streptococcus pneumonia, лишенные гена luxS, не в состоянии формировать биопленку [22].

ComABCDE-система

При формировании биопленки бактерии Streptococcus pneumoniae используют компетентстимулирующую ComABCDE-систему кворум-сенсинга, основным лигандом которой является компетентстимулирующий пептид (competing stimulating peptide — CSP), участвующий в формировании клонов компетентных пневмококков. Основным отличием данных пневмококковых клонов является их способность продуцировать гидролитические ферменты, участвующие в высвобождении ДНК из некомпетентных бактерий, которая в последующем подлежит рекомбинации с ДНК компетентных пневмококков [4, 9]. Естественная трансформация и хромосомная интеграция экзогенной ДНК являются основным механизмом горизонтального переноса генов и геномного преобразования у пневмококков. Raphaël Laurenceau и соавторы [13] определили, что компетентные пневмококки высвобождают спиральные нити, которые морфологически и композиционно похожи на пили 4-го типа (type 4 pili — T4P) грамотрицательных бактерий и выполняют роль рецептора ДНК. Авторы считают, что данные нити, сплетенные из полимеров, представляют собой спиросомы — макромолекулярные платформы для сборки ацетальдегиддегидрогеназы AdhE (acetaldehyde-alcohol dehydrogenase), наличие которой характерно для широкого спектра грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Пептид CSP является дериватом протеина — предшественника ComC (competence stimulating peptide (CSP) precursor). После отщепления от протеина — предшественника ComC пептид CSP экспортируется из бактерий при помощи АТФ-связывающей кассетной транспортерной системы ComAB. При достижении пептидом CSP критической внеклеточной концентрации индуцируется взаимодействие CSP с рецепторной гистидинкиназой ComD, которая передает сигнал возбуждения, перенося фосфатную группу на молекулы регуляторов родственного ответа ComE и ComX [6, 28]. В связи с этим индукция компетентности в бактериях Streptococcus pneumoniae делится на две фазы: фазу раннего ответа, индуцируемую ComE, и фазу позднего ответа, индуцируемую ComX. Фосфорилированная молекула ComE активирует транскрипцию обязательных Com-генов: ComCDE, ComAB, ComX и ComW, способствующих развитию компетентного состояния, и необязательных генов, в частности гена comW. Протеин ComW является положительным регулятором компетентности, который способствует сборке эффекторного комплекса, состоящего из регулятора ComX и РНК-полимеразы (RNAP). Продукт ComX, кодируемый двумя идентичными генами, действует как альтернативный сигма-фактор, который инициирует транскрипцию генов, необходимых для поглощения и рекомбинации ДНК, а также для активации поздних Com генов. Группа генов поздней фазы содержит более 80 представителей, но только 14 из них были определены как необходимые для осуществления трансформации бактерий. Максимальная активность экспрессии генов, индуцированных регулятором ComE, отмечается через 7,5–10 минут, а генов, индуцированных ComX, — примерно через 12,5–15 минут после индукции CSP (рис. 1) [7, 19].

Активация QS-ассоциированных генов приводит к изменению спектра продукции факторов вирулентности и формированию биопленки (табл. 1).

Биопленку формируют неинвазивные пневмококковые клоны, которые, как правило, инфицируют носоглотку, откуда образующиеся планктонные инвазивные формы могут транслоцироваться в другие компартменты организма. В связи с этим пневмококковая инфекция протекает в виде двух клинических вариантов: клоны неинвазивного биопленочного фенотипа вызывают хроническое течение инфекционного процесса носоглотки; клоны инвазивных пневмококков индуцируют развитие острых заболеваний (отитов, пневмоний). Согласно современным представлениям развитие системной инвазивной пневмококковой инфекции должно включать: 1) формирование хронического биопленочного процесса в носоглотке; 2) возникновение в биопленке инвазивных клонов; 3) проникновение инвазивных клонов в легкие с последующим возникновением бактериемии [4, 5, 9].

Медикаментозное влияние на QS бактерий Streptococcus pneumoniae может способствовать предупреждению развития рецидивирующих заболеваний и выздоровлению после острых пневмококковых инфекций.

Лекарственные средства, подавляющие развитие биопленки у бактерий Streptococcus pneumoniae

Создание лекарственных средств, оказывающих ингибирующее влияние на формирование биопленок бактерий Streptococcus pneumoniae, связано с разнообразием штаммов. Установлено, что различные штаммы S-бактерий Streptococcus pneumoniae характеризуются особенностями функционирования механизмов, образующих биопленку [8].

Продемонстрировано, что рост биопленки бактерий Streptococcus pneumoniae подавляют гипометилирующее соединение 5-азацитидин [27], аналог SAM синефунгин [24] и ингибитор Dam — пиримидиндион [26].

Соединение 5-азацитидин (5-azacytidine) ингибирует синтез наиболее распространенной сигнальной молекулы QS грамположительных бактерий аутоиндуктора AI-2 [21]. Соединение 5-азацитидин является производным цитидина, которое вызывает гипометилирование ДНК и ингибирует ДНК-метилтрансферазу. SAM-зависимые метилтрансферазы играют критическую роль в различных биологических реакциях, включая метилирование ДНК. Известно, что метилирование цитозина (C-5 и N-4) и аденина (N-6) оказывает регуляторный эффект на активность транскрипции генов. Также накопление токсичных метилтиоаденозина и S-рибозилгомоцистеина может привести к гибели бактериальной клетки. Учитывая, что детоксикация SAH бактериями Streptococcus pneumoniae осуществляется с помощью нуклеозидазы MTA/SAH (pfs), участвующей в синтезе AI-2, применение 5-азацитидина вызывает не только подавление формирования биопленки, но и гибель микроорганизмов [27].

Синефунгин является естественным нуклеозидом и структурным аналогом SAM. Он ингибирует реакции трансметилирования, ассоциированные с ДНК, РНК, протеинами и другими молекулами [24]. Синефунгин обладает противовирусной [11] и противогрибковой [15] активностью. Синефунгин достоверно подавляет колонизацию пневмококками среднего уха у экспериментальных крыс. Синефунгин на 92 % подавляет продукцию AI-2 и ингибирует не только рост пневмококковой биопленки in vitro, процесс колонизации Streptococcus pneumoniae in vivo, но и экспрессию генов luxS, pfs и speE [24].

Перспективными ингибиторами QS являются соединения, подавляющие активность бактериальной ДНК-аденин-метилтрансферазы (DNA adenine methyltransferase — Dam), в частности пиримидиндиона. Бактериальный фермент Dam катализирует перенос метильной СН₃ группы от SAM на аденин, расположенный в шестом положении в дуплексной ДНК. Данное метилирование аденина является уникальным процессом, характерным феноменом исключительно для бактерий. SAM-опосредованное метилирование ДНК необходимо для биосинтеза некоторых QS-ассоциированных молекул и вторичных метаболитов, в частности полиаминов, которые играют определенную роль в образовании биопленки [18].

Пиримидиндион эффективно ингибирует рост пневмококковой биопленки как на ранней, так и на поздней стадии ее формирования. Также пиримидиндион подавляет рост биопленок, образованных и другими бактериями, в том числе золотистым стафилококком, метициллинрезистентным золотистым стафилококком (methicillin-resistant Staphylococcus aureus — MRSA) и Staphylococcus epidermidis [26]. Пиримидиндион подавляет экспрессию не менее 13 генов бактерий Streptococcus pneumoniae, в том числе генов, кодирующих факторы вирулентности (ply, srtA, ptrA, lytB, nrc и SPD_1295), определяющие развитие инфекционного процесса. Так, ген ply кодирует пневмолизин, который вызывает клеточный лизис и играет ключевую роль в пневмококковой инвазии; ген srtA кодирует адгезин, ответственный за адгезию бактерий к эпителиоцитам глотки человека; ген prtA кодирует ассоциированную со стенкой пневмококков сериновую протеазу A, которая предопределяет тяжесть внутрибрюшинных инфекций; ген lytB кодирует холинсвязывающий протеин, а гены nrc и spd_1295 кодируют гемолитические протеины [26].

Mukesh Kumar Yadav и соавторы [26] полагают, что пиримидиндиониндуцированное ингибирование роста биопленки обусловлено подавлением экспрессии генов системы компетентности и генов, ассоциированных с формированием биопленки. Так, пиримидиндион подавляет экспрессию гена ComC, который кодирует ключевой лиганд CSP-1 компетентстимулирующей системы ComABCDE бактерий Streptococcus pneumoniae.

Выводы

Бактерии Streptococcus pneumoniae занимают ведущее место в этиологии острых бактериально-ассоциированных заболеваний респираторного тракта у детей. Бактерии Streptococcus pneumoniae обладают способностью формировать биопленки, которые обеспечивают им защиту от действия антибиотиков, антимикробных пептидов и возникновение инвазивных бактериальных клонов. Организация биопленок колониями бактерий Streptococcus pneumoniae связана с функционированием QS-систем — LuxS/AI-2 и ComABCDE. Препараты, подавляющие возникновение и рост биопленки бактерий Streptococcus pneumoniae, представлены 5-азацитидином, синефунгином и пиримидиндионом. Разработка новых лекарственных средств, направленных на подавление формирования биопленок, позволит повысить эффективность антистрептококковой терапии.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии какого-либо конфликта интересов при подготовке данной статьи.