Журнал «Здоровье ребенка» Том 14, №3, 2019

Введение

В этиологической структуре инфекционных заболеваний грамположительные бактерии Staphylococcus aureus входят в топ-пятерку патогенных агентов. Микроорганизмы Staphylococcus aureus не случайно получили характеристику «двуликого Януса» [5], так как, представляя собой оппортунистические патогены, могут вызвать инфекционный процесс с тяжелым инвазивным течением. Так, открытые в 1961 году штаммы бактерий Staphylococcus aureus, резистентные к действию метициллина (methicillin-resistant Staphylococcus aureus — MRSA) [15], являются ведущей причиной тяжелых нозокомиальных инфекций в странах всего мира [18]. Особенно высокий риск развития MRSA-ассоциированных инфекций отмечается у недоношенных и новорожденных детей с очень низкой массой тела [43], для которых характерен низкий уровень экспрессии образраспознающих рецепторов [1]. Медикаментозное лечение инфекций, вызванных MRSA, является чрезвычайной проблемой современной медицины [11, 22]. Одним из важнейших механизмов, опосредующих развитие антибиотикорезистентности, считают формирование бактериальных биопленок [10, 27, 36], в связи с чем лекарственные средства, ингибирующие механизмы кворум-сенсинга (quorum sensing — QS), представляют собой класс медикаментов, которые, по мнению многих ученых, в недалеком будущем позволят решить терапевтическую задачу лечения больных с инфекционными процессами, вызванными высокопатогенными бактериями MRSA.

Механизмы формирования биопленки бактериями Staphylococcus aureus

Стафилококковые бактерии при формировании биопленки используют систему регулятора аксессуарного гена (accessory gene regulator — Agr), двухкомпонентную систему RAP/TRAP и, вероятно, систему LuxS [24]. Система Agr бактерий Staphylococcus aureus контролирует экспрессию генов факторов вирулентности (гемолизинов, лейкоцидинов, адгезинов, экзоферментов) и генов, участвующих в формировании биопленки. Локус Agr (3,5 кб) состоит из двух транскрипционных единиц — RNAII и RNAIII — c промоторами P₂ и P₃ соответственно. Транскрипционная единица RNAII содержит четыре гена: AgrB, AgrD, AgrC и AgrA. Ген AgrD кодирует пептид, который является предшественником эффекторного внеклеточного сигнала Agr-системы кворум-сенсинга, получившего название аутоиндукторного пептида (autoinducing peptide — AIP). Молекула AIP состоит из 7–9 аминокислотных остатков и 5-членного тиолактонного кольца. Пептид AgrB, который представляет собой трансмембранную пептидазу с молекулярной массой тела 22 кДа, расположенный в цитоплазматической мембране, протеолизирует пептид AgrD до AIP, который и экспортирует из бактерии. Окончательное созревание пептида AIP во внеклеточной среде связано с действием пептидазы типа SspB. Бактерии Staphylococcus aureus могут продуцировать четыре аллельных варианта AIP: вариант I характеризуется аминокислотной последовательностью YSTCDFIM; вариант II — GVNACSSLF, вариант III — INCDFLL и вариант IV — YSTCYFIM. Каждый вариант AIP транскрибируется из собственного Agr-оперона и связывается со своей соответствующей киназой AgrC (рис. 1) [41].

Гены agrC и agrA кодируют двухкомпонентную сигнальную систему трансдукции, включающую сенсорную гистидинкиназу AgrC и регулятор ответа — пептид agrA. Сенсор AgrC является трансмембранным протеином, принадлежащим к семейству рецепторных гистидинпротеинкиназ. При помощи N-терминального мембранно-интегрированного сенсорного модуля гистидинкиназа AgrC обнаруживает и связывает AIP. После того как AIP связывается с сенсорным модулем протеина AgrC, происходит изменение конформации эндодомена молекулы AgrC, обусловливающее аутофосфорилирование и активацию киназы AgrC. Активированная гистидинкиназа AgrC фосфорилирует гомодимер AgrA, который связывается с промоторной областью P₂, индуцируя генерацию транскрипта RNAII, и с промоторной областью P₃, вызывая генерацию транскрипта RNAIII, которые способствуют продукции определенных QS-ассоциированных продуктов (рис. 2) [19, 32, 41].

Транскрипция RNAIII также зависит от активности двухкомпонентной QS-системы — RAP/TRAP. Протеин RAP (RNAIII activating protein) представляет собой секретируемую бактериями молекулу, которая, достигая критического уровня концентрации, участвует в активации протеина TRAP, известного как мишень RAP (target of RAP — TRAP). Высококонсервативный, конститутивно экспрессируемый, мембраносвязанный протеин TRAP после RAP-опосредованного фосфорилирования индуцирует экспрессию транскрипта RNAIII [2].

Система Agr является глобальным регулятором активности генов стафилококков [27]. Данная QS-система бактерий Staphylococcus aureus контролирует экспрессию более 100 факторов вирулентности [19]. Система Agr индуцирует экспрессию нескольких генов вирулентности, фенолсолютабных модулинов, токсинов, вызывающих шок (toxic shock syndrome toxins — TSST), и др. Представляет интерес то, что антисмысловой транскрипт RNAIII индуцирует продукцию a-гемолизина и других токсинов, протеаз, протеинов капсулы и в то же время подавляет продукцию поверхностного протеина A, который позволяет Staphylococcus aureus уклоняться от опсонизации, и адгезинов [27].

Система Agr активно участвует в формировании Staphylococcus aureus-ассоциированной биопленки. В экспериментальных условиях установлено, что добавление AIP в стафилококковую колонию способствует организации биопленки [28].

Система QS бактерий Staphylococcus aureus способствует инвазии при остром течении заболевания, а QS-зависимое формирование биопленки обусловливает рецидивирующее и хроническое течение инфекционного процесса [7, 19].

Обращает на себя внимание то, что в течение стафилококковой инфекции in vitro наблюдается появление мутантных бактериальных клонов, обладающих резко сниженной QS-активностью. Данные клоны, по-видимому, являются социальными бактериальными читерами, которые эксплуатируют кооперативные межбактериальные связи, не привнося свой вклад в пул факторов вирулентности, то есть тяжесть инфекционного процесса обратно пропорциональна доле читеров в популяции патогена. Учитывая, что соотношение между представительством кооперативных бактерий и читеров предопределяет вероятность летального исхода заболеваний, наличие бактериальных читеров может являться своеобразным микробиологическим признаком благоприятного исхода. Медикаментозное усиление генерации читеров может стать одним из направлений лечения, предупреждающих тяжелое течение заболевания [25].

Лекарственные средства, подавляющие развитие биопленки у бактерий Staphylococcus aureus

Среди ингибиторов QS бактерий Staphylococcus aureus различают несколько групп соединений, отличающихся по механизму действия (табл. 1).

Подавление экспорта AIP из бактериальной клетки

Результаты исследования, проведенного Daniel A. Todd и соавторами [33], свидетельствуют о том, что амбуиновая кислота (ambuic acid), представляющая собой высокофункциональный циклогексенон, выделенный из эндофитных грибов Pestalotiopsis spp. и Monochaetia sp., обладает мощным ингибирующим эффектом на биосинтез трансмембранной пептидазы AgrB. Подавление активности AgrB сопровождается снижением уровня высвобождения AIP во внеклеточное пространство и подавлением активности экспрессии нескольких генов, контролируемых Agr-системой бактерий Staphylococcus aureus (рис. 3) [34].

Блокада гистидинкиназы AgrC

В последнее время активно разрабатываются соединения, предупреждающие формирование биопленки бактериями Staphylococcus aureus за счет блокирования гистидинкиназы AgrC.

Наиболее многочисленной и изученной группой антибиопленочных средств являются соединения, структурно имитирующие AIP [35]. Так, идентифицированы четыре нефункциональных пептидных аналога AIP, которые предупреждают активацию гистидинкиназы AgrC [37]. Согласно мнению Yftah Tal-Gan и соавторов [30], наиболее эффективными синтетическими ингибиторами AgrC QS-системы бактерий Staphylococcus aureus являются AIP III D4A, tAIP III D2A, AIP III N2A/D4A и AIP III I1A/N2A/D4A.

Циклический пептид авелланин C, полученный из грибов Hamigera ingelheimensis, является выраженным конкурентом с AIP в процессе связывания с рецептором AgrC и блокирует активацию сигнального каскада, способствующего продукции факторов вирулентности и компонентов биопленки [14].

Показано, что нерибосомальный депсипептид солонамид B (solonamide B), синтезируемый морскими бактериями Photobacterium halotolerance spp. strain S2753, и его аналоги подавляют экспрессию a-гемолизина и фенолсолютабных модулинов бактерий Staphylococcus aureus. Однако солонамиды оказывает незначительное влияние на формирование биопленки. Солонамид B и его аналоги конкурентно ингибируют активность Agr-системы, препятствуя связыванию AIP с киназой AgrC [4, 12].

На основании скрининга 1000 соединений культуральных экстрактов актиномицетов Said E. Desouky и соавторы [9] установили, что три циклодепсипептида: WS9326A, WS9326B и кохинмицин II/III — обладают способностью подавлять активность Agr-системы бактерий Staphylococcus aureus. Соединения WS9326A и WS9326B ингибируют гемолиз, индуцированный бактериями Staphylococcus aureus.

Jingru Li и соавторы [21] определили, что пробиотические бактерии Lactobacillus reuteri RC-14 продуцируют малые сигнальные молекулы — циклические дипептиды: cyclo(L-Phe-L-Pro) и cyclo(L-Tyr-L-Pro), которые способны влиять на функционирование стафилококковой QS-системы и подавлять активность системы TSST-1 менструального штамма MN8 Staphylococcus aureus. Данные циклические дипептиды ингибируют транскрипцию всех генов локуса Agr бактерий Staphylococcus aureus и генов-регуляторов факторов вирулентности sarA и saeRS.

Ewan J. Murray и соавторы [23] показали, что 3-оксо-C₁₂-HSL-1 бактерий Pseudomonas aeruginosa подавляет активность Agr-системы бактерий Staphylococcus aureus (рис. 4). Авторами разработана серия аналогов 3-оксо-C12-HSL, тетраминовой и тетрановой кислот, ингибирующих формирование биопленки бактерий Staphylococcus aureus. Вещество 3-оксо-C₁₂-HSL также является модулятором иммунного и воспалительного ответа, активности эпителиального барьера.

Ингибирование экспрессии и функциональной активности AgrA

Активность экспрессии AgrA может быть успешно ингибирована антисмысловым олигонуклеотидом PLNA34, нарингенином и малой молекулой савирином.

Fei Da и коллеги [8] синтезировали антисмысловой олигонуклеотид PLNA34, ингибирующий экспрессию agrA и эффекторной молекулы RNAIII штамма USA300 LAC бактерий Staphylococcus aureus. Также PLNA34 ингибирует экспрессию таких Agr-ассоциированных вирулентных генов, как Hla, Psma, Psmb и Pvl. Бактериальные стафилококковые колонии после инкубации с олигонуклеотидом PLNA34 теряют свою гемолитическую активность и способность лизировать и рекрутировать нейтрофилы. Применение антисмыслового олигонуклеотида PLNA34 способствует выздоровлению мышей с экспериментальной кожной инфекцией, вызванной MRSA.

Антиоксидант нарингенин (naringenin) — 4',5,7-тригидроксилаванон — представляет собой флавоноид, в частности, гликозилированный флаванон, и представляет собой агликон нарингенина (нарингенин-7-рамноглюкозид), который обладает противовирусной и антибактериальной активностью [13, 42]. Ингаляционное введение нарингенина в концентрации 16 мкг/мл мышам с пневмонией, вызванной бактериями Staphylococcus aureus, способствует выраженному подавлению экспрессии a-токсина микроорганизмами и снижению активности воспалительного процесса в ткани легкого у экспериментальных животных. Авторы считают, что нарингенин является перспективным терапевтическим средством для лечения стафилококковых инфекций.

Идентифицировано соединение, ингибирующее AgrA, из категории малых молекул, которое получило название «савирин» (S. aureus virulence inhibitor — savirin) [29]. Савирин блокирует связывание AgrA с его сайтами связывания на промоторных регионах, что предотвращает активацию экспрессии генов AgrA и AgrC, транскрипта RNAIII и, как следствие, продукцию многочисленных секретируемых факторов вирулентности (рис. 5).

Ингибирование экспрессии транскрипта RNAIII

Первым ингибитором транскрипта RNAIII был идентифицирован гептапептид — YSPWTNF — RNAIII-ингибирующий пептид (RNAIII inhibiting peptide — RIP), способный подавлять активность инфекционного стафилококкового процесса. Пептид RIP ингибирует фосфорилирование протеина TRAP, который создает аутоиндуцирующую петлю синтеза RNAIII [2].

Для улучшения эффективности и стабильности действующей молекулы проведены различные модификации пептида RIP.

Согласно результатам сканирования пептида RIP было установлено, что основной действующей аминокислотной последовательностью является YSPWT, которая более активно подавляет жизнедеятельность бактерий Staphylococcus aureus, чем полная форма — YSPWTNF — пептида RIP [3].

Oriana Simonetti и коллеги [26] синтезировали аналоги RIP — FS (1–11), из которых наибольшей антибиопленочной антистафилококковой активностью обладали соединения FS3, FS8 и FS10. Примечательно, что тетрапептид FS10, представляющий последовательность H-Ser-Pro-Trp-Thr-NH₂, содержит пролиновый остаток в Р₂ и треониновый остаток в Р₄ положениях. Данная композиция аминокислотных остатков является ключевым молекулярным фактором, который структурно ассоциирован с ингибированием жизнедеятельности стафилококковых бактерий.

Другой аналог RIP — 16P-AC (CH₃CO-YKPVTNF-ST-YKPVTNF-CONH₂) — достоверно подавляет формирование биопленки и адгезию бактерий MRSA. Применение пептида 16P-AC в дозе 10 мг/кг сопровождается достоверным снижением уровня бактериурии, количества КОЕ в тканях почек, мочевого пузыря у инфицированных крыс. Авторы полагают, что 16P-AC является молекулой, которая заслуживает дальнейшего исследования ее антибиопленочных возможностей [45].

В коре кустарникового ореха (Hamamelis virginiana) идентифицирован натуральный полифенол, принадлежащий семье танинов, непептидный аналог RIP — 2,5-ди-O-галоил (хамамелитанин — hamamelitannin), достоверно ингибирующий активность экспрессии транскрипта RNAIII бактерий Staphylococcus aureus. Хамамелитанин ингибирует фосфорилирование протеина TRAP, что приводит к снижению вирулентности и подавлению процесса формирования биопленки [38]. В настоящее время синтезировано несколько аналогов хамамелитанина и установлено, что они достоверно потенцируют активность ванкомицина при проведении лечения инфекционных заболеваний, вызванных MRSA [39].

Другие соединения, обладающие способностью ингибировать активность Agr-системы бактерий Staphylococcus aureus

В настоящее время идентифицировано несколько химических соединений, блокирующих экспрессию определенных факторов вирулентности бактерий Staphylococcus aureus. В частности, показано, что нестероидный противовоспалительный препарат дифлунизал (diflunisalum), одобренный Федеральным управлением по лекарственным средствам, ингибирует продукцию a-гемолизина и a-токсина дозозависимым образом без ингибирования роста бактерий [17]. J. Matthias Walz и соавторы [40] считают, что дифлунизал может быть использован при лечении инфекций, вызванных бактериями Staphylococcus aureus.

Продемонстрировано, что за счет содержания производного терпеноидов цис-неролидола эфирные масла черного перца, кананги и мирта ингибируют формирование биопленки бактерий Staphylococcus aureus. Применение эфирных масел черного перца приводит к подавлению активности экспрессии генов a-токсина (hla), нуклеазы и регуляторных генов QS-систем [20].

Выводы

Одной из чрезвычайных проблем современной инфектологии является лечение заболеваний, вызванных антибиотикорезистентными штаммами бактерий Staphylococcus aureus, способных формировать устойчивые к внешним воздействиям биопленки. Заболевания, ассоциированные с бактериями MRSA, характеризуется неблагоприятным течением и высоким риском летального исхода. Организация стафилококковых биопленок связана с функционированием таких QS-систем, как Agr и RAP/TRAP. Кроме участия в формировании биопленок эти системы регулируют экспрессию генов токсинов, фенолсолютабных модулинов, протеаз, протеинов капсулы бактерий. Основными направлениями, которые считают перспективными для разработки антибиопленочных препаратов, являются: подавление экспорта AIP из бактериальной клетки; ингибирование активности гистидинкиназы AgrC, экспрессии и функциональной активности AgrA, экспрессии транскрипта RNAIII. Не вызывает сомнения то, что препараты, которые будут разработаны для подавления активности QS-механизмов бактерий Staphylococcus aureus, займут достойное место в антистафилококковой терапии.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии какого-либо конфликта интересов при подготовке данной статьи.