Международный неврологический журнал №3 (105), 2019
Фібриновий біоматрикс як середовище для підтримки життєдіяльності, направленого диференціювання та трансплантації нейрогенних прогеніторних клітин різного походження (огляд)
Авторы: Олексенко Н.П.
ДУ «Інститут нейрохірургії ім. акад. А.П. Ромоданова Національної академії медичних наук України»,
м. Київ, Україна
Рубрики: Неврология
Разделы: Справочник специалиста
Резюме
Завданням новітніх нейрорегенеративних клітинних технологій є відновлення ушкодженої 3D структури нервової тканини і пошуки адекватного матриксу для трансплантації клітин. Фібриновий 3D матрикс має безперечні переваги: відсутність токсичності, можливість біодеградації, здатність до інтеграції трансплантованих клітин у тканину і підтримки їх функціональної активності. Фібриновий згусток може бути отриманий за 1–2 години до застосування, він є автологічним матеріалом, що усуває етичні проблеми та запобігає інфікуванню і розвитку імуноконфліктів. Він також є джерелом трофічних факторів (PDGF, TGFβ, IGF, VEFG, EGF та ін.), незамінних амінокислот і може бути збагачений іншими біологічно активними речовинами для стимуляції спрямованого диференціювання. Таким чином, фібриновий 3D матрикс формує сприятливе мікрооточення для нейрональних прогеніторів, а також стовбурових та прогеніторних клітин іншого походження. Спостереження у культурі показали покращення життєздатності, зростання проліферативної активності, нейрон- та ангіогенез. Отже, фібриновий 3D матрикс безперечно має великий потенціал для застосування у нейрорепаративних клітинних технологіях.
Задачей новых нейрорегенеративных клеточных технологий является восстановление поврежденной 3D структуры нервной ткани и поиск адекватного матрикса для трансплантации клеток. В этом смысле фибриновый 3D матрикс имеет несомненные преимущества: отсутствие токсичности, возможность биодеградации, способность к интеграции трансплантированных клеток в ткань и поддержки их функциональной активности. Фибриновый сгусток может быть получен за 1–2 часа до использования, является аутологичным материалом, что устраняет этические проблемы и предотвращает инфицирование и развитие иммуноконфликтов. Он также является источником трофических факторов (PDGF, TGFβ, IGF, VEFG, EGF и др.), незаменимых аминокислот и может быть обогащен другими биологически активными веществами для стимуляции направленной дифференцировки. Таким образом, фибриновый 3D матрикс формирует благоприятное микроокружение для нейрональных предшественников, а также для стволовых и прогениторных клеток другого происхождения. Наблюдения в культуре показали повышение выживаемости, рост пролиферативной активности, нейро- и ангиогенез. Следовательно, фибриновый 3D матрикс имеет большой потенциал для использования в нейрорепаративных клеточных технологиях.
The task of modern neuroregenerative cell technology is to recover damaged 3D structure of nerve tissue and find adequate matrix for transplanted cells. In this sense, fibrin 3D matrix has the following advantages: the absence of toxicity, the possibility of biodegradation, the maintenance of integration and supporting functional activity of targeted transplanted cells into the tissue. Fibrin clot can be obtained for 1–2 hours before the need to use; this is autologous material that removes the ethical issues, problems of immunologic havoc and infection; this is an inexpensive method. It’s a source of growth factors (PDGF, TGFβ, IGF, VEFG, EGF and others), essential amino acids and can be enriched with other bioactive substances to stimulate direct differentiation. So, fibrin 3D matrix is forming favorable microenvironment for nerve cells progenitors and stem cells and progenitors of other origin. Monitoring of cell culture shows the stimulation of viability, proliferation, neuron- and angiogenesis. Thus, fibrin 3D matrix has a large potential for using in the neuroreparative cell technology.
Ключевые слова
фібрин; 3D матрикс; нейрональні прогенітори; MSC; нейрональне диференціювання; огляд
фибрин; 3D матрикс; нейрональные прогениторы; MSC; нейрональная дифференцировка; обзор
3D matrix; neuronal progenitors; MSC; neuronal differentiation; review
Біоконструкції на основі фібрину останнім часом почали широко використовуватися у регенеративній медицині, але найчастіше для відновлення твердих тканин як з’єднувального елемента. В той же час є всі підстави сподіватися, що цей матеріал має перспективи широкого застосування для нейрорепарації. Фібриновий матрикс має тривимірну структуру, що дозволяє створювати специфічну цитоархітектоніку, спектр трофічних факторів, що здійснюють також і нейротрофічну дію, пори для аксональної інвазії, а також може бути автологічним, що знімає етичні питання, проблеми імуноконфліктів, потенційного інфікування та полегшує біодеградацію.
Особливістю нервової тканини є важливість для нейроклітин позиційної інформації, оскільки її функціонування безперечно пов’язане із встановленням контактів. Тому культивування у тривимірних структурах відкриває можливості для більш повної реалізації генетичної програми в умовах in vitro, здійснення направленого диференціювання клітинної популяції та покращує перспективи застосування її у вигляді ней-рорепаративного трансплантата in vivo.
Також існує можливість використання клітинами фібрину як поживної речовини. Він містить ізолейцин, лейцин, лізин, метіонін, треонін, триптофан, фенілаланін, що є незамінними амінокислотами для людини, а також широкий спектр інших амінокислот, необхідних для побудови цитоскелета клітин нервової системи [1]. Зокрема, пролін є важливим структурним елементом МАP-2, а високий вміст глутамінової та аспарагінової кислот і фенілаланіну відзначено у складі S100 [1–3]. Отже, фібриновий матрикс створює сприятливе мікрооточення, здійснюючи трофічну підтримку структурної репарації різних типів клітин нервової системи.
Додаткове насичення фібринового матриксу біологічно активними речовинами відкриває широкі можливості для здійснення трофічного впливу на тканини реципієнта, а також підтримання життєздатності і направленого нейрогенного диференціювання клітин трансплантату. Існують дані щодо застосування при цьому ретиноєвої кислоти, фактора росту нервів (nerve growth factor — NGF), епідермального фактора росту (epidermal growth factor — EGF), фактора росту фібробластів (fibroblast growth factor — FGF) [4–6]. Таким чином, досягається пролонгація трофічного впливу та активація регенеративних процесів шляхом хемотаксичної атракції в організмі господаря, а також захист та первинна трофічна підтримка трансплантованих клітин.
Залежно від мети дослідження та перспектив використання на сьогодні розробляється широкий спектр фібринових 3D матриксів. При цьому створюються як конструкції на основі самого фібрину, так і з додаванням інших полімерів та біологічно активних речовин.
Для отримання матриксів на основі фібрину найчастіше використовують хімічно очищений фібриноген, що дозволяє точно дозувати його вміст у широких ме–жах від 2,5 до 141 мг/мл, залежно від очікуваної щільності матеріалу [7–9]. Щільність полімерної конструкції тісно пов’язана з наявністю та діаметром пор. Показано, що їх діаметр можна корегувати, впливаючи на умови полімеризації, зокрема концентрацію NaCl, KCl, CaCl [8, 10].
При отриманні 3D структури на основі поєднання фібринового матриксу з іншими полімерами найчастіше використовується полімолочна гліколева кислота (poly-lactic-glycolic asid — PLGA), агароза, колаген та хітозан [11–13]. Два останні, зазвичай, застосовують для формування зовнішнього каркасу у вигляді трубки [11, 13]. Отже, у разі потреби досягають додаткової щільності зовнішніх боків конструкції та уповільнюють біодеградацію.
Окреме місце посідає технологія Fibrin microbeads (FMB) — отримання фібринових мікроструктур (розміром 105–180 мкм) [11]. Це досягається інтенсивним перемішуванням під час полімеризації, що призводить до утворення крапельної емульсії. Краплі висушують за допомогою органічних розчинників і в такому вигляді зберігають для подальшого використання [11]. Перевагами цього метода є можливість довгого зберігання матеріалу у сухому вигляді та додаткової стерилізації в разі необхідності. FMB використовують у разі потреби заповнити певний об’єм складної форми у зоні ураження. Гранули FMB можуть бути носіями стовбурових клітин (СК) або нейротрофічних речовин, наприклад NGF, створюючи градієнт для аксональної регенерації [11, 14].
Останнім часом для покращення результатів трансплантації стовбурових клітин приділяється увага матриксу, отриманому з використанням фібрину, збагаченого тромбоцитами (platelet reach fibrin — PRF) [15]. При цьому застосовується природний процес згортання крові, що обумовлено перетворенням розчинного фібриногену у необоротний гель фібрин, складовою частиною якого є збагачена тромбоцитами плазма (ЗТП). Вважається, що властивості ЗТП визначаються тромбоцитами, які є джерелом факторів росту, що містяться в α-гранулах. Активація тромбоцитів супроводжується дегрануляцією з викидом факторів росту. Найбільш важливі — це platelet-derived growth factor (PDGF), transforming growth factor β (TGFβ), insulin-like growth factor (IGF), vascular endothelial growth factor (VEGF) та epidermal growth factor (EGF) [9, 16, 17]. Фактори росту стимулюють ангіогенез, клітинну проліферацію, диференціацію та утворення екстраклітинного матриксу, тобто здійснюють комплексну репараційно-стимулюючу дію, що також має потужний нейротрофічний потенціал.
На наявність PDGF реагують всі клітини нервової системи — нейрони, астроцити, олігодендроцити та їх попередники [18, 19]. Нейрональні стовбурові клітини субвентрикулярної зони, яка є основним джерелом ней-рогенезу, мають рецептори до PDGF α та β, зберігаючи їх навіть у дорослому віці [20]. Сприймаючи сигнал, клітини нервової системи реагують залежно від типу та ступеня диференціювання. Так, попередники олігодендроцитів за наявності цього фактора стимулюються до активної проліферації [18, 21]. Цим пояснюється ефективне застосування PRF матриксу для ремієлінізації. Подібним впливом на олігодендроцити відомий і протизапальний цитокін TGFβ [22]. Нейротрофічна дія IGF-1 полягає у здійсненні нейропротекторної функції після травми та стимуляції нейропластичного потенціалу шляхом підсилення генерації нових нейронів [23–25]. IGF-1 стимулює нейрональне диференціювання нервових прогеніторних клітин, зв’язуючись із рецептором IGF-1Rs та активуючи PISK/Akt і MARK/Erk метаболічні шляхи [25]. Наявність IGF-1 активує проліферацію PC-12 та шванівських клітин, збільшує експресію генів, що кодують білки цитоскелета — NF та MAP-2, власного рецептора та одного з найважливіших нейротрофінів — NGF [24]. Все це дало можливість визнати його потенційним лікувальним агентом при нейротравмі. EGF стимулює до проліферації та міграції в зону ушкодження популяції клітин B1 із субвентрикулярної зони, які під його впливом диференціюються у гліальні попередники NG2+, а потім у пре-олігодендроцити [26]. Також він здійснює нейропротекторний ефект при травмі через антиапоптичний вплив. A.M. Ozturk (2018) із співавторами показали, що в умовах спінальної та черепно-мозкової травми інфузія EGF значно знижує експресію проапоптичних генів Bax та Bcl-2 та активує антиоксидантні ферменти — каталазу, супероксиддисмутазу (СОД) та глутатіонпероксидазу [27]. Найвідоміша функція VEGF — це ангіогенез, що експресується після ішемічної травми у нейронах [28]. Але крім цього, є дані про те, що він пригнічує реактивний астрогліоз — основну причину рубцевих змін у ЦНС, запобігаючи тим самим розвитку післяопераційних ускладнень [29]. Отже, завдяки вищезгаданим факторам PRF матрикс має широкий нейротрофічний потенціал — від генерації нових популяцій нейронів до активації процесів ремієлінізації та пригнічення реактивного гліозу [18, 19, 21–25, 28, 29].
Широкий спектр біоконструкцій на основі фібрину дозволяє створити сприятливі умови для впливу на диференціювання прогеніторних клітин у потрібному напрямку, зокрема нейрогенному. Нейрогенне диференціювання у 3D фібриновому матриксі здійснюється із застосуванням нервових стовбурових та прогеніторних клітин (НСК та НПК), а також мезенхімальних стовбурових клітин (МСК) різного походження — з кісткового мозку, жирової тканини та крові. Як нейрональні попередники у дослідженнях найчастіше використовують фетальні НСК та ПК, популяцію нейронів dorsal root ganglion, клітинні лінії PC12 та шванівські клітини [5–9, 30–32].
Перевагою тривимірного культивування, безперечно, є можливість досягти щільності клітин на одиницю об’єму, що близька до такої в організмі, формування специфічної цитоархітектоніки нервової тканини. Все це є елементами позиційної інформації, що сприяють найбільш повній реалізації генетичної програми при культивуванні СК та ПК, а також підвищують життє-здатність і приживлення трансплантата при його використанні для нейрорепарації, що і є кінцевою метою подібних розробок.
Експериментально переваги тривимірного культивування були показані S. Sandri із співавторами (2014) на нейрогенних лініях клітин [6]. Зокрема, з використанням методу TUNEL було продемонстровано зниження ступеня апоптозу при культивуванні у 3D фібриновому матриксі порівняно із 2D фібриновим покриттям [6]. Також показано, що тривимірна структура сприяє швидкій зупинці проліферації та початку стадії диференціювання нейробластів [6].
При культивуванні у 3D фібриновому матриксі дослідники одностайно відзначають високу життєздатність та активне нейрогенне диференціювання у популяціях [7, 5, 31], що підтверджено дослідженням експресії специфічних білків цитоскелета нейронального типу: βІІІ-тубуліну, NF-200, MMP-2 та MMP-2/9 [7]. Показано формування зрілих нейронів різної нейромедіаторної специфічності [7]. При цьому збільшення щільності фібринового матриксу гальмує диференціювання [7].
Активні процеси нейрорегенерації спостерігаються і в нейронах дорсальних гангліїв під час їх культивування у фібриновому матриксі. Зокрема, показано збільшення загальної довжини нейритів та їх чисельності, експресія металопротеїнази та серинової протеази, міграція та аксональна інвазія вздовж фібринових волокон [8, 9].
У нашому власному дослідженні ми використовували для культивування нервових клітин новонародженого щура 3D PRF матрикс людини різної щільності [33]. Експерименти показали, що при нанесенні клітин на його зовнішню поверхню активно формується зона росту, мережа відростків, встановлюються контакти між клітинами, утворюється конфлюентний шар клітин. При введенні клітин у середину 3D PRF матриксу спостерігається активна міграція клітин на зовнішню поверхню, всередині матриксу клітини формують контакти, мережу відростків, що утворюють нейритно-гліальні волокна, які проростають назовні, а також зберігають структуру після деградації матриксу. Швидкість цих процесів залежить від щільності матриксу. Отже, формується сприятливе середовище, в якому відсутня токсична дія щодо нервових клітин, які активно формують мережу відростків та встановлюють контакти.
Також важливим інструментом у регуляції нейрогенного диференціювання є насичення фібринового матриксу ростовими факторами та іншими інформаційно важливими для нейропрогеніторних клітин молекулами. Так, його збагачують BDNF, NGF, VEGF, MDL 28170, а також T1, HYD1 та A5G81, що є лігандами до інтегринових рецепторів ά6β1 та ά3β1, таким чином сприяючи закріпленню та активації НСК та НПК [5, 30, 32]. При цьому, порівняно із звичайним фібриновим матриксом, у 2,4 раза збільшується швидкість формування мережі відростків, у 2 рази — швидкість аксональної регенерації, зростає зона p43+, маркера конусу росту аксонів [32].
Культивування у фібриновому матриксі є засобом іммобілізації клітинної популяції, що є дуже важливим для закріплення її в зоні ураження при нейротрансплантації. Так, при трансплантації НК у зону спінальної травми спостерігається добра приживлюваність трансплантата та подальше проростання аксонів крізь зону ураження вздовж фібринових волокон, що продемонстровано P. Lu із співавторами у 2014 та 2017 роках за допомогою використання генетично модифікованих НСК, що експресують GFP [5, 30].
Також досліджувалася поведінка клітинних ліній нейрогенного походження при культивуванні у фібриновому 3D матриксі. Популяція лінії шванівських клітин, інкорпорована у PRF матрикс, ефективно сприяє відновленню функцій ушкодженого сідничного нерва при трансплантації в зону дефекту [31]. Розчинні компоненти матриксу при додаванні їх in vitro стимулювали проліферацію лінії шванівських клітин, а також секрецію ними NGF та GDNF [31]. Дослідники запропонували навіть термін «concentrated growth factor (CGF) complex of fibrin matrix» [31]. У культурах лінії PC12 та ембріональних нервових клітин у фібриновому матриксі, збагаченому ретиноєвою кислотою та NGF, показане зростання чисельності MAP2- та β-тубулін-позитивних клітин, а також загальної довжини нейритів, що, безперечно, свідчить на користь активного нейрогенного диференціювання [6].
Тривимірне культивування створює нові можливості для моделювання різних процесів в умовах in vitro. 2017 року японськими дослідниками була запропонована модель дослідження нейроваскуляризації [34]. Одночасне культивування НСК та МСК у матриксах на основі фібрину призводило до утворення розгалуженої нейрональної мережі та капіляроподібних структур — neurovascular units (NVU). Безперечно, такі розробки важливі не лише для біомоделювання, а і для вдосконалення методів клітинної терапії нейродегенеративних захворювань.
Стовбурові та прогеніторні клітини ненейрогенного походження, інкорпоровані у фібриновий матрикс, також можуть стимулювати нейрорегенерацію. Насамперед це МСК кісткового мозку та жирової тканини, також зустрічаються окремі роботи про застосування з цією метою мононуклеарів крові [4, 9–14, 34–37].
ADSC (adipose-derived stem cells) вважають перспективним матеріалом для клітинної терапії. Перевагою їх використання є легкість отримання з мінімально травматичною хірургічною процедурою, велика чисельність порівняно з іншими тканинами дорослого організму, здатність до адгезії, завдяки якій легко ізолювати фракцію стовбурових та прогеніторних клітин із загальної популяції, та швидка проліферація [11–13, 38].
Нейрорепаративні властивості ADSC дослідники пов’язують насамперед із їх здатністю диференціюватися у шванівські клітини [39, 40], що експериментально підтверджено експресією S100, P75 та інших маркерів [13, 39]. Направлене диференціювання здійснюється in vitro за допомогою двостадійного культивування із застосуванням нейроіндукторів та міогенів — ретиноєвої кислоти, PDGF, bFGF та ін. [41]. Також деякі автори пов’язують нейрорегенеративні властивості ADSC із експресією нейротрофінів BDNF та GDNF [24, 42].
Такий достатньо обмежений потенціал нейрогенного диференціювання обумовив застосування ADSC для регенерації ушкоджених периферичних нервів [1–13, 43–45]. За останні 10 років проведено численні успішні експерименти з регенерації дефекту сідничного нерва завдовжки 10–15 мм, із застосуванням ADSC людини та щура, інкорпорованих у фібриновий гідрогель без додаткових компонентів або з додаванням PLGA (poly-lactic-co-glycolic asid), агарози та колагену [11–13, 43]. Автори спостерігали збереження високої життєздатності клітин, динаміку чисельності, зростання експресії S100, P75, MAG, PO, білків нейрофіламентів та ламініну. Ці показники свідчать про активну аксональну регенерацію та ремієлінізацію нервового волокна, що корелює з функціональним відновленням організму [11–13, 43].
На відміну від ADSC BMSC (bone marrow stem cells) мають більш широкий потенціал диференціювання, але отримати їх значно складніше і чисельність обмежена [46].
Нейрорепаративні властивості BMSC визначаються їхньою властивістю до нейрогенного диференціювання та синтезу нейротрофічних факторів, що стимулюють проліферацію шванівських клітин [4, 14, 35, 47, 48]. На сьогодні дослідниками продемонстровано 2 типи нейрогенного диференціювання BMSC — у нейрони та шванівські клітини. Нейрогенне диференціювання було проведено безпосередньо у фібриновому матриксі A.V. Shakhbazau із співавт. (2011) із застосуванням факторів-мітогенів EGF та FGF, а також нейрогенного середовища, що містило ретиноєву кислоту, і підтверджено появою βІІІ-тубулін-позитивних клітин [49]. Направлене диференціювання BMSC у шванівські клітини також широко застосовується у наукових та клінічних експериментах, здійснюється під впливом цитокінів і підтверджується появою відповідних маркерів — S100, P75, GFAP та ін. [14, 37, 50, 51].
Сьогодні клінічне застосування BMSC знаходиться в сфері репарації ушкоджених периферичних нервів. N. Hu зі співавт. [52] успішно використали трансплантат із інкорпорованими BMSC для регенерації дефекту нерва завдовжки 50 мм. Для трансплантації BMSC у зону ураження найчастіше використовують фібриновий матрикс відносно низької щільності (2,5 мг/мл фібриногену), а також його модифікації з хітозаном та іншими полімерами [14, 37, 52]. При цьому ефективно стимулюються процеси аксональної регенерації, мієлінізації, а також функціональне відновлення.
2012 року F. Ye з колегами використали PRF матрикс у комбінації з PLGA, заповнений BMSC, що попередньо підлягали стимуляції спрямованого диференціювання у шванівські клітини, для регенерації дефекту сідничного нерва (10 мм) у кроликів [53]. Контрольну групу становили тварини, в яких для заповнення дефекту був використаний фібриновий матрикс із такими самими клітинами. Через 12 тижнів чисельність відновлених нервових волокон та товщина мієлінової оболонки були значно більші у разі використання PRF-матриксу. Кращими були і функціональні показники сідничного нерва [53].
Питання про механізми нейрорегенеративного впливу МСК залишається відкритим. Так, є експериментальні дані про те, що навіть недиференційовані BMSC у зоні дефекту нерва стимулюють власні шванівські клітини завдяки експресії нейротрофінів [48]. Можливо висловити припущення, що це є відповіддю BMSC на сигнальні білки нейротравми, що синтезуються ушкодженою нервовою тканиною. C. Lööv із співавт. встановили в післятравматичному культуральному середовищі наявність 53 специфічних білків [54]. При цьому важливо, що фібриновий матрикс має пористу структуру, що забезпечує взаємообмін речовин між трансплантатом і господарем [4].
Фібриновий матрикс також може використовуватися для направленого диференціювання МСК пуповинної крові. S. Yao із співавт. (2016) успішно стимулювали нейрогенез у культурі цих клітин людини за допомогою нейроіндукторів у фібриновому гідрогелі [9].
Останніми роками дослідників зацікавили адгезивні властивості фібрину. Так, S. Tara та I.K. Krishnan (2015) встановили, що саме на ньому на відміну від інших полімерних матриксів (желатин, ламінін) адгезуються потенційні нейрональні попередники з циркулюючого пулу СК крові [10]. Висновки були зроблені за наявності нейрональних маркерів — Nest+, MAP2+, βІІІ-тубулін+ та експресії тирозингідроксилази та синапсину [6, 10].
Наведені дані переконливо доводять, що фібринові матрикси мають відмінну сумісність із широким спектром клітинних популяцій різного походження, створюючи сприятливе середовище для їх трофічної підтримки та запрограмованого направленого нейрогенного диференціювання. Тривимірна цитоархітектоніка матриксу сприяє аксональній інвазії, можливість контролю щільності — міграції клітин, у разі потреби, а також швидкості біодеградації. При цьому для клінічного застосування важливим є те, що матрикс може бути автологічним, що знімає численні проблеми.
Таким чином, фібринові матрикси з репаративною метою можуть ефективно застосовуватися при широкому спектрі нейродегенеративних захворювань.
Конфлікт інтересів. Автор заявляє про відсутність конфлікту інтересів при підготовці даної статті.
Список литературы
1. Litvinov R.I., Gorkun O.V., Owen S.F., Shuman H., Weisel J.W. // Blood. 2005. Nov 1; 106(9): 2944-51.
2. Краснов А.В. Астроцитарные белки головного мозга: структура, функции, клиническое значение // Неврологический журнал. 2012; 1: 37-42.
3. Cargnello M., Roux P.P. Activation and function of the MAPKs and their substrates, the MAPK-activated protein kinases // Mol. Biol. Rev. 2011 Mar; 75(1): 50-83
4. Савчук О.М., Чернишов В.І., Волков Г.Л. Дослідження властивостей згустків, сформованих із дезАА- та дезААВВ-фібрину з різною структурою поверхні // Біополімери і клітина. 2006. 22(2): 102-108.
5. Robinson J., Lu P. Optimization of trophic support for stem cell graft in sites of spinal cord injury // Exp. Neurol. 2017 May; 291: 87-97. doi: 10.1016/j.expneurol.2017.02.007.
6. Sadri S., Khazaei M., Ghanbari A., Khazaei M.R., Shah P. Neuronal differentiation of PC12 and embryonic stem cells in two- and three-dimensional in vitro culture // Indian J. Exp. Biol. 2014 Apr; 52(4): 305-11; № 4.
7. Bento A.R., Quelhas P., Oliveira M.J., Pêgo A.P., Amaral I.F. Three-dimensional culture of single embryonic stem-derived neural/stem progenitor cells in fibrin hydrogels: neuronal network formation and matrix remodeling // J. Tissue Eng. Regen. Med. 2017 Dec; 11(12): 3494-3507. doi: 10.1002/term.2262.
8. Man A.J., Davis H.E., Itoh A., Leach J.K., Bannerman P. Neurite outgrowth in fibrin gels is regulated by substrate stiffness // Tissue Eng. Part. A. 2011 Dec; 17(23–24): 2931-2942. doi: 10.1089/ten.tea.2011.0030.
9. Yao S., Liu X., Yu S., Wang X., Zhang S., Wu Q. et al. Co-effects of matrix low elasticity and aligned topography on stem cell neurogenic differentiation and rapid neurite outgrowth // Nanoscale. 2016 May 21; 8(19): 10252-65. doi: 10.1039/c6nr01169a.
10. Tara S., Krishnan L.K. Bioengineered fibri-based niche to direct outgrowth of circulating progenitors into neuron-like cells for potential use in cellular theraphy // J. Neural. Eng. 2015 Jun; 12(3): 036011. doi: 10.1088/1741-2560/12/3/036011.
11. Carriel V., Garrido-Gomez J., Hernandez-Cortes P., Garzón I., García-García S., Sáez-Moreno J.A. Combination of fibrin-agarose hydrogels and adipose-derived mesenchymal stem cells for peripheral nerve regeneration // J. Neural. Eng. 2013 Apr; 10(2): 026022. doi: 10.1088/1741-2560/10/2/026022.
12. Carriel V., Scionti G., Campos F., Roda O., Castro B., Cornelissen M. et al. In vitro characterization of a nanostructered fibrin agarose bio-artificial nerve substitute // J. Tissue Eng. Regen. Med. 2015 May; 11(5): 1412-1426. doi: 10.1002/term.2039.
13. Schuh C.M., Morton T.J., Banerjee A., Grasl C., Schima H., Schmidhammer R. et al. Activation of schwann cell-like cells on aligned fibrin-poly (lactic-co-glycolic acid) structures: a novel construct for application in peripheral nerve regeneration // Cells Tissues Organs. 2015; 200(5): 287-99. doi: 10.1159/000437091.
14. Yasuda H., Kuroda S., Shichinohe H., Kamei S., Kawamura R., Iwasaki Y. Effect of biodegradable fibrin scaffold on survival, migration and differentiation of transplanted bone marrow stromal cells after cortical injury in rats // J. Neurosurg. 2010 Feb; 112(2): 336-44. doi: 10.3171/2009.2.JNS08495.
15. Tatullo M., Marrelli M., Cassetta M., Pacifici A., Stefanelli L.V., Scacco S. et al. Platelet rich fibrin (P.R.F.) in reconstructive surgery of atrophied maxillary bones: Clinical and histological evaluations // Int. J. Med. Sci. 2012; 9(10): 872-80. doi: 10.7150/ijms.5119.
16. Amable P.R., Carias R.B.V., Teixeira M.V.T. da Cruz Pacheco I., Corrêa do Amaral R.J., Granjeiro J.M. et al. Platelet-rich plasma preparation for regenerative medicine: optimization and quantification of cytokines and growth factors // Stem. Cell. Researh. & Therapy. 2013 Jun 7; 4(3): 67. doi: 10.1186/scrt218.
17. Hotwani K., Sharma K. Platelet rich fibrin — a novel acumen into regenerative endodontic therapy // Restor. Dent. Endod. 2014 Feb; 39(1): 1-6. doi: [10.5395/rde.2014.39.1.1].
18. Abbaszadeh H.A., Tiraihi T., Delshad A., Saghedizadeh M., Taheri T., Kazemi H. et al. Differentiation of neurosphere-derived rat neural stem cells into oligodendrocyte-like cells by repressing PDGF-α and Olig2 with triiodothyronine // Tissue Cell. 2014 Dec; 46(6): 462-9. doi: 10.1016/j.tice.2014.08.003.
19. Sil S., Periyasamy P., Thangarai A., Buch S. PDGF/PDGFR axis in the neural system // Mol. Aspects Med. 2018 Aug; 17(30): 133-134. doi: 10.1016/j.mam.2018.01.006.
20. Moore L., Bain J.M., Loh J.M., Steven W., Levison. PDGF-responsive progenitors persist in the subventricular zone across the lifespan // ASN Neuro. 2014 Feb 7; 2(6): eoo137. doi: [10.1042/AN20120041].
21. Hill R.A., Patel K.D., Medved J., Reiss A.M., Nishiyama A. NG2 cells in white matter but not gray matter proliferate in response to PDGF // J. Neurosci. 2013 Sep 4; 33(36): 14558-66. doi: 10.1523/JNEUROSCI.2001-12.2013.
22. Glannakopoulou A., Grigoriadis N., Polyzoidou E., Lourbopoulos A., Michaloudi E., Papadopoulos G.C. Time-dependent fate of transplanted neural precursor cells in experimental autoimmune encephalomyelitis mice // Exp. Neurol. 2011 Jul; 230(1): 16-26. doi: 10.1016/j.expneurol.2010.04.011.
23. Carlson S.W., Saatman K.E. Central infusion of IGF-1 increases hyppocampal neurogenesis and improves neurobehavioral function following traumatic brain injury // J. Neurotrauma. 2018 Jul 1; 35(13): 1467-1480. doi: 10.1089/neu.2017.5374.
24. Li J.A., Zhao C.F., Li S.J., Zhang J., Li Z., Zhang Q. et al. Modified insulin-like growth factor 1 containing collagen-binding domain for nerve regeneration // Neural Regen Res. 2018. Mar 16; 13(2): 298-303. doi: [10.4103/1673-5374.226400].
25. Wang Y., Zhang D., Zhang Y., Ni N., Tang Z., Bai Z. et al. Insulin-like growth factor-1 regulation of retinal progenitor cell proli-feration and differentiation // Cell. Cycle. 2018; 17(4): 515-526. doi: 10.1080/15384101.2018.1431594.
26. Gonzalez-Perez O., Romero-Rodriguez R., Soriano-Navarro M., Garcia-Verdugo J.M., and Alvarez-Buylla A. Epidermal growth factor induces the progeny of subventricular zone type B cells to migrate and differentiate into oligodendrocytes // Stem. Cells. 2009 Aug; 27(8): 2032-43. doi: [10.1002/stem.119].
27. Ozturk A.M., Sozbilen M.C., Sevgili E., Dagci T., Özyalcin H., Armagan G. Epidermal growth factor regulate apoptosis and oxidative stress in a rat model of spinal cord injury // Injury. 2018 Jun; 49(6): 1038-1045. doi: 10.1016/j.injury.2018.03.021.
28. Esposito E., Hayakawa K., Ahn B.J., Chan S.J., Xing C., Liang A.C. et al. Effects of ischemic post-conditioning on neuronal VEGF regulational and microglial polarization in a rat model of focal cerebral ischemia // Neural. Regen. Res. 2018 Jul; 146(2): 160-172. doi: 10.1111/jnc.14337.
29. Park M.N., Lee J.Y., Jeong M.S., Jang H.S., Endo S., Bae J.S. et al. The roll of Purkinje cell-derived VEGF in cerebellar astrogliosis in Niemann-Pick type C mice // BMB Rep. 2018 Feb; 51(2): 79-84.
30. Lu P., Grahman L., Wang Y., Wu D., Tuszynski M. Promotion of survival and differentiation of neural stem cells with fibrin and growth factor coctails after severe spinal cord injury // J. Vis. Exp. 2014 Jul 27; (89): e50641. doi: 10.3791/50641.
31. Qin J., Wang L., Sun Y., Sun X., Wen C., Shahmoradi M. et al. Concentration growth factor increases Schwann cell proliferation and neurotrophic factor secretion and promotes functional nerve recovery in vivo // Int. J. Mol. Med. 2016 Feb; 37(2): 493-500. doi: 10.3892/ijmm.2015.2438.
32. Silva J., Bento A.R., Barros D., Laundos T.L., Sousa S.R., Quelhas P. et al. Fibrin functionalization with synthetic adhesive ligands interacting with α6β1 integrin receptor enchance neurite outgrowth of embryonic stem cell-derived neural stem/progenitors // Acta Biomater. 2017 Sep 1; 59: 243-256. doi: 10.1016/j.actbio.2017.07.013.
33. Tsymbalyuk V.I., Vasylyeva I.G., Oleksenko N.P. Interaction of components in 3D PRF matrix and neuronal cells in vitro. Advances in tissue engineering and regenerative medicine. 2017. Aug 15; 5(2): 000044. doi: 10.17265/2328-2150/2017.08.005.
34. Uwamori H., Higuchi T., Arai K., Sudo R. Integration of neurogenesis and angiogenesis models for constructing a neurovascular tissue // Sci. Rep. 2017 Dec 11; 7(1): 17349. doi: 10.1038/s41598-017-17411-0.
35. Fathi S.S., Zaminy A. Stem cell theraphy for nerve injury // World J. Stem Cells. 2017 Sep 26; 9(9): 144-151. doi: [10.4252/wjsc.v9.i9.144].
36. Jose A., Krishnan L.K. Effect of matrix composition on differentiation of nestine-positive neural progenitors from circulation into neurons // J. Neural. Eng. 2010 Jun; 7(3): 036009.
37. McGrath A.M., Brohlin M., Kingham P.J., Novikov L.N., Wiberg M., Novikova L.N. Fibrin conduit supplemented with human mesenchymal stem cells and immunosuppressive treatment enchances regeneration after peripheral nerve injury // Neurosci Lett. 2012 May 16; 516(2): 171-6. doi: 10.1016/j.neulet.2012.03.041.
38. Sterm B.M., Hicok K.C., Zhu M., Wulur I., Alfonso Z., Schreiber R.E. et al. Multipotential differentiation of adipose tissue-derived cells // Keio J. Med. 2005 Sep; 54(3): 132-41.
39. Kingham P.J., Kalbermatten D.F., Mathay D., Armstrong S.J., Wiberg M., Terenghi G. Adipose-derived stem cells differentiate into Schwann cell phenotype and promote neurite outgrowth in vitro // Exp. Neurol. Oct; 2007(2): 267-74.
40. di Summa P.G., Kingham P.J., Raffoul W., Wiberg M., Terenghi G., Kalbermatten D.F. Adipose-derived stem cells enchance peripheral nerve regeneration // J. Plast. Reconstr. Aesthet. Surg. 2010 Sep; 63(9): 1544-52. doi: 10.1016/j.bjps.2009.09.012.
41. Yu H., Peng J., Guo Q., Zhang L., Li Z., Zhao B. et al. Improvement of peripheral nerve regeneration in acellular nerve grafts with local release of nerve growth factor // Microsurgery. 2009; 29(4): 330-336. doi: 10.1002/micr.20635.
42. Widgerow A.D., Salibian A.A., Lalezari S., Evans G.R. Neuromodulatory nerve regeneration: adipose tissue-derived stem cells and neurotrophic mediation in peripheral nerve regeneration // J. Neurosci Res. 2013 Dec; 91(12): 1517-24. doi: 10.1002/jnr.23284.
43. di Summa P.G., Kingham P.J., Raffoul W., Wiberg M., Terenghi G., Kalbermatten D.F. Adipose-derived stem cells enchance peripheral nerve regeneration // J. Plast. Reconstr. Aesthet. Surg. 2010 Sep; 63(9): 1544-52. doi: 10.1016/j.bjps.2009.09.012.
44. Oliveira J.T., Almeida F.M., Biancalana A., Baptista A.F., Tomaz M.A., Melo P.A. et al. Mesenchymal stam cells in a polycaprolactone conduit enchance median-nerve regeneration, prevent decrease of creatine phosphokinase levels in muscle and improve functional recovery in mice // Neuroscience. 2010 Nov 10; 170(4): 1295-303. doi: 10.1016/j.neuroscience. 2010.08.042.
45. Orbay H., Uysal A.C., Hyakusoku H., Mizuno H. Differentiated and undifferentiated adipose-derived stem cells improve fubction in rats with peripheral nerve gaps // J. Plast. Reconstr. Aesthet. Surg. 2012 May; 65(5): 657-64. doi: 10.1016/j.bjps.2011.11.035.
46. Garsia-Castro J., Trigueros C., Madrenas J., Pérez-Simón J.A., Rodriguez R., Menendez P. Mesenchumal stem cells and their use as cell replacement therapy and disease modeling tool // J. Cell. Mol. Med. 2008 Dec; 12(6B): 2552-65. doi: 10.1111/j.1582-4934.2008.00516.x.
47. Chen C.J., Ou Y.C., Liao S.L., Chen S.Y., Wu C.W., Wang C.C. et al. Transplantation of bone marrow stromal cells for peripheral nerve repair // Exp. Neurol. 2007 Mar; 204(1): 443-53.
48. Wang J., Ding F., Gu Y., Gu X. Bone marrow mesenchymal stem cells promote cell proliferation and neurotrophic function of Schwann cells in vitro and in vivo // Brain Res. 2009 Mar 25; 1262: 7-15. doi: 10.1016/j.brainres.2009.01.056.
49. Shakhbazau A.V., Petyovka N.V., Kosmacheva S.M., Potapnev M.P. Neurogenic induction of human mesenchymal stem cells in fibrin 3D matrix // Bull. Exp. Biol. Med. 2011 Feb; 150(4): 547-50. doi: 10.1007/s10517-011-1186-2} •.
50. Keilhoff G., Stang F., Goihl A., Wolf G., Fansa H. Transdifferentiated mesenchymal stem cells as alternative therapy in supporting nerve regeneration and myelination // Cell. Mol. Neurobiol. 2006 Oct-Nov; 26(7–8): 1235-52.
51. Raheja A., Suri V., Sarkar C., Sarkar C., Srivastava A., Mohanty S. et al. Dose-dependent facilitation of peripheral nerve regeneration by bone marrow-derived mononuclear cells: a randomized controlled study: laboratory investigation // J. Neurosurg. 2012 Dec; 117(6): 1170-81. doi: 10.3171/2012.8.JNS111446.
52. Hu N., Wu H., Xue C., Gong Y., Wu J., Xiao Z. Long-term outcome of the repair of 50 mm long median nerve defects in rhesus monkeys with marrow mesenchymal cells-containing chitosan-based engineered nerve grafts // Biomaterials. 2013 Jan; 34(1): 100-11. doi: 10.1016/j.biomaterials.2012.09.020.
53. Ye F., Li H., Qiao G., Feng Chen, Hao Tao, Aiyu Ji et al. Platelet-rich plasma gel in combination with Schwann cells for repair of sciatic nerve injury // Neural. Regen. Res. 2012 Oct 15; 29(7): 2286-2292. doi: [10.3969/j.issn.1673-5374.2012.29.007].
54. Lööv C., Shevchenko G., Nadadhur A.G., Clausen F., Hil-lered L., Wetterhall M. et al. Identification of injury specific proteins in a cell culture model of traumatic brain injury // PLOS. 2013 February 7. Available from; https://doi.org/10.1371/journal.pone.0055983.
