Газета «Новости медицины и фармации» №12 (700), 2019

Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются основной причиной смерти в мире. По оценкам экспертов, ССЗ уносят жизни 17,9 миллиона человек ежегодно, что составляет примерно 31 % всех смертей в мире, из которых 85 % связаны с ишемической болезнью сердца (ИБС), включая инфаркт миокарда и инсульт. Из-за их широкой распространенности и высокой смертности ССЗ стали основной проблемой общественного здравоохранения [1, 2]. Хотя традиционные факторы риска для этих патологических состояний, к которым относятся гипертензия, сахарный диабет, табакокурение и гиперхолестеринемия, позволили создать модель для прогнозирования риска, тем не менее до 20 % пациентов с ишемической болезнью сердца не имеют этих факторов, а 40 % имеют только один [3]. Более того, в 35 % случаев у больных с ИБС, которые умерли, уровень холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) был в пределах нормальных значений [4]. Такая стратегия с использованием модели для прогнозирования риска ССЗ является экономически неэффективной и ограничена прогностической ценностью. Дальнейшие исследования, направленные на улучшение стратификации риска при ССЗ, привели к созданию и внедрению в практическую медицину новых биомаркеров, среди которых высокочувствительный С-реактивный белок (hs-CRP), мозговой натрийуретический пептид (NT-proBNP) и липопротеин-ассоциированная фосфолипаза А2 (Lр-PLA2). В клинических исследованиях было показано, что активность и масса Lp-PLA2 в плазме тесно связаны с атерогенными липидами и сосудистым риском, что послужило основанием для применения данного фермента в качестве биомаркера сердечно-сосудистых заболеваний, а ингибирование его активности может представлять привлекательную терапевтическую стратегию.

Биохимические свойства и механизм действия Lp-PLA2

Липопротеин-ассоциированная фосфолипаза А2, также известная как ацетилгидролаза фактора активации тромбоцитов (PAF-AH), принадлежит к суперсемейству фосфолипаз А2 и является Са2⁺-независимой фосфолипазой, которая кодируется геном PLA2G7, состоящим из 12 экзонов и 11 интронов, локализованных на хромосоме 6р21.2-12 [5–7]. Lp-PLA2 представляет собой белок с м.в. ~ 45,4 кДа (величина переменная из-за высокой степени гликозилирования), имеющий 441 аминокислотный остаток. Этот фермент характеризуется своей способностью специфически гидролизовать фактор активации тромбоцитов (1-0-алкил-2-ацетил-СН-глицерил-3-фосфорилхолин, или PAF), а также глицерофосфолипиды, содержащие короткие и/или окисленные группы жирных кислот в положении sn-2 глицеринового остова. Lp-PLA2 имеет в своем активном центре каталитическую триаду из трех аминокислот серин/аспартат/гистидин, находящихся соответственно в положениях 273, 296 и 351, которая линейно ориентирована и соответствует конформации α/β-гидролазы для нейтральных липаз и эстераз, что было подтверждено ее кристаллической структурой в растворе [8, 9]. Основными источниками Lp-PLA2 в плазме являются Т-лимфоциты, моноциты/макрофаги, активированные тучные клетки и клетки печени [10]. В крови фермент циркулирует в виде активных форм и с образованием комплексов. Так, 70–80 % Lp-PLA2 связаны с ЛПНП в результате специфического взаимодействия «белок — белок» между N-терминальным остатком Lp-PLA2 и С-терминальным остатком аполипротеина АроВ. Остальные 20–30 % распределяются между липопротеинами высокой плотности (ЛПВП), липопротеинами очень низкой плотности (ЛПОНП) и липопротеином (а) (Lp(a)) [11]. После окисления ЛПНП короткая ацильная группа в положении sn-2 фосфолипидов становится восприимчивой к гидролитическому действию Lp-PLA2 и продуцирует мощный провоспалительный и проатерогенный медиатор лизофосфатидилхолин (лизо-ФХ), а также окисленные неэтерифицированные жирные кислоты. Лизофосфатидилхолин является мощным хемоаттрактантом для Т-лимфоцитов и моноцитов, индуцирует апоптоз гладкомышечных клеток, приводит к эндотелиальной дисфункции и стимулирует экспрессию молекул адгезии и цитокинов (рис. 1).

Связь липопротеин-ассоциированной фосфолипазы А2 с риском ССЗ

Интерес к Lp-PLA2 как к биомаркеру ССЗ возник после публикации отчета WOSCOPS (West of Scotland Coronary Prevention Study), в котором была показана положительная связь между увеличением концентрации Lp-PLA2 в крови и риском коронарных событий [12]. Один из важных выводов WOSCOPS заключался в том, что в отличие от таких воспалительных биомаркеров, как h-CRP, количество лейкоцитов и фибриногена, только ассоциация Lp-PLA2 с риском коронарных событий не зависела от действия других факторов. Это было подтверждено в других исследованиях, включая MONICA (MONItoring of trends and determinants in Cardiovascular disease) [13], Rotterdam Study [14], Rancho Bernardo [15] и Bruneck [16]. В метаанализе Collaboration [17] такая связь была изучена в 32 проспективных исследованиях, которые включали 79 000 участников (35 945 субъектов, не имеющих в анамнезе сосудистые заболевания в начале исследования, 32 453 пациента со стабильной ишемической болезнью сердца и 10 638 пациентов с диагнозом «острый коронарный синдром»). При анализе учитывалась корректировка по возрасту, полу и факторам липидного и нелипидного риска. У здоровых людей не обнаружена связь между активностью Lp-PLA2 и коронарными заболеваниями сердца или ишемическим инсультом.

В многочисленных публикациях приводятся данные эпидемиологических исследований, наглядно подтверждающие наличие связи между уровнем Lp-PLA2 и риском возникновения ССЗ. Исследования, в которых оценивалась роль Lp-PLA2 как фактора, влияющего на стратификацию риска ССЗ, представлены в табл. 1 [18].

В настоящее время определение Lp-PLA2 включено в американские и европейские протоколы оценки сердечно-сосудистого риска для пациентов: ACCF/AHA Guideline for Assess-ment of Cardiovascular Risk in Asymptomatic Adults (2010), AHA/ASA Guidelines for the Primary Prevention of Stroke (2011), AACE Guidelines for Management of Dyslipidemia and Prevention of Atherosclerosis (2012), Euro-pean Guidelines on CVD Prevention in Clinical Practice — European Society of Cardiology (2012) [19, 20].

Методы определения Lp-PLA2

Для определения Lp-PLA2 используются два метода — определение концентрации фермента (по массе) и его ферментативной активности. Необходимо отметить, что еще в 2005 г. после многолетних проспективных исследований тест для измерения массы Lp-PLA2 был официально одобрен FDA (Food and Drug Administration, US) для оценки риска ССЗ и ишемического инсульта [21].

Измерение Lp-PLA2 (по массе)

Для определения Lp-PLA2 по массе используется коммерческий набор PLAC^® Mass Test (diaDexus Inc., South San Francisco, CA). В 2016 г. компания Diazyme Laboratories приобрела все активы diaDexus Inc., по-этому наборы PLAC^® для пользователей сейчас предлагает Diazyme Laboratories Inc., Poway, California, USA.

Тест основан на принципе иммуноферментного анализа (ELISA, сэндвич-метод) с использованием двух специфических моноклональных антител. Плазму добавляют в лунки микропланшета с анти-Lp-PLA2 моноклональными антителами (2С10) и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем добавляют вторые моноклональные антитела (4В4), меченные ферментом пероксидазы хрена, и инкубируют в течение 180 мин. Лунки промывают и добавляют субстрат тетраметилбензидин. После 20 мин инкубации измеряют поглощение при 450 нм, которое прямо пропорционально концентрации Lp-PLA2 в плазме. Концентрация Lp-PLA2 выражается в единицах нг/мл (область измерения — 1,2–2000 нг/мл).

Измерение Lp-PLA2 (активность)

Набор PLAC^® Тest Activity (Diazyme Laboratories Inc.) основан на определении ферментативной активности Lp-PLA2 в сыворотке или плазме. При определении активности Lp-PLA2 происходит гидролиз субстрата 1-миристоил-2-(4-нитрофенил-сукцинила) фосфатидилхолина в положении sn-2 с образованием окрашенного продукта реакции 4-нитрофенола. Скорость образования 4-нитрофенола измеряется спектрофотометрически, а активность Lp-PLA2 рассчитывается по скорости изменения абсорбции. Активность фермента выражается в единицах нмоль/мин/мл (область измерения — 10–382 нмоль/мин/мл).

Важно отметить, что измерения Lp-PLA2 по массе и активности представляют частично потенциально разные физиологически значимые виды Lp-PLA2. Метод определения Lp-PLA2 по массе заключается в том, что эпитопы фермента подвергаются воздействию антител в присутствии интактных липопротеинов, тогда как при анализе активности Lp-PLA2 это осуществляется после деструкции липопротеинов детергентом. Поэтому определение Lp-PLA2 по массе представляет собой так называемую экспозиционную Lp-PLA2, а Lp-PLA2-активность — это общие Lp-PLA2 в плазме [22].

Хотя в клинических исследованиях было показано, что с риском ССЗ связаны оба параметра, характеризующие Lp-PLA2 (масса и ферментативная активность), в настоящее время только тест для определения Lp-PLA2 (масса) разрешен для клинического применения. Этому тесту присвоен также знак CE, подтверждающий соответствие стандартам качества и безопасности Европейского союза.

Референтные значения Lp-PLA2

Повышение концентрации Lp-PLA2 имеет клинический пограничный уровень — 200 нг/мл, выше которого риски резко возрастают (рис. 2).

Во многих клинических лабораториях рекомендуются следующие референтные уровни Lp-PLA2 [23]:

— низкий риск < 200 нг/мл;

— пограничный диапазон 200–235 нг/мл;

— высокий риск > 235 нг/мл.

Клиническое использование Lp-PLA2: экспертные рекомендации

Для улучшения прогнозирования риска развития ССЗ следует измерять уровень Lp-PLA2 и использовать полученные данные в дополнение к традиционным факторам риска [24]. Измерение уровня Lp-PLA2 рекомендуется проводить у пациентов с умеренным риском (предположительно здоровые лица с двумя или более традиционными факторами риска, что по Фрамингемской шкале 10-летнего риска соответствует 10–20 %), а также у пациентов с высоким риском (установленный диагноз ИБС или факторами риска, равнозначными ИБС), нуждающихся в более радикальной коррекции стиля жизни и липид-модифицирующей терапии. Клиническим порогом, который предоставляет право на переклассификацию риска, является значение Lp-PLA2 ≥ 200 нг/мл. Эта величина получена на основе обзора исследований, в которых был показан заметный рост риска наступления сердечно-сосудистых событий у пациентов с превышением данного порога [25, 26]. Таким образом, лица из группы умеренного риска, у которых были определены значения Lp-PLA2 ≥ 200 нг/мл, реклассифицируются и получают статус пациентов с высоким риском развития ИБС, а пациенты с ИБС или факторами риска, равнозначными ИБС, и повышенным уровнем Lp-PLA2 переводятся в группу очень высокого риска (рис. 3).

Выводы

Сердечно-сосудистые заболевания являются одной из основных причин заболеваемости и смертности в мире. Частота ССЗ в значительной степени может быть предотвращена или сведена к минимуму, если на ранней стадии выявлены факторы риска. Одним из высокоспецифических биомаркеров является липопротеин-ассоциированная фосфолипаза А2, которая считается самостоятельным фактором риска ССЗ.

Преимущества и отличия Lp-PLA2 по сравнению с другими тестами:

1. Увеличение уровней Lp-PLA2 не зависит от традиционных сердечно-сосудистых факторов риска.

2. Lp-PLA2 является ферментом, продуцируемым макрофагами, инфильтрованными в атеросклеротических бляшках, поэтому его определение более специфично по сравнению с другими воспалительными маркерами.

3. Определение Lp-PLA2 помогает выявить скрытый риск сердечно-сосудистых событий, которые могут быть пропущены при использовании стандартных факторов риска (например, уровень холестерина, артериальное давление, семейный анамнез, табакокурение).

4. Уровни липидов не могут предоставить достаточно информации о состоянии стенки артерии, в то время как Lp-PLA2 отражает этот статус независимо от других сердечно-сосудистых маркеров.

5. Lp-PLA2 специфичен для сосудов и не продуцируется при других воспалительных процессах в отличие от прочих воспалительных маркеров (например, hs-СRP).

6. Мониторинг за снижением Lp-PLA2 и ЛПНП в ответ на терапию является лучшим индикатором эффективности лечения по сравнению только с определением ЛПНП.

7. Lp-PLA2 имеет минимальную биологическую вариабельность.

8. По результатам определения Lp-PLA2 возможно определить цель и дальнейшую стратегию лечения пациента.