Международный эндокринологический журнал Том 15, №4, 2019

Визначення пролiферативного потенцiалу клiтин пухлини — важливе завдання для дiагностики раку щитоподібної залози (ЩЗ). Тому необхiдний пошук маркерів, які характеризують стан пролiферативних процесів, на базі вивчення факторів, що беруть участь у поділі клітини, та дослідження експресiї генiв, продукти яких беруть участь у пiдготовцi i здiйсненнi подiлу клiтин.

Одним із маркерів пролiферативних процесів є ядерний антиген пролiферуючих клiтин (PCNA) — бiлок, необхiдний для органiзацiї компонентiв, що беруть участь у процесах реплiкацiї та репарацiї ДНК у часі і просторі. Бiлки поєднуються в межах мiждоменної сполучної петлi PCNA, i значна частина регуляторних впливiв є результатом конкурування за цей стикувальний сайт. Білок PCNA є еволюційно консервативним у всіх еукаріотів. У людини знайдено два варіанти гена, що кодує цей білок, крім того, його псевдогени описані на хромосомах 4 і Х.

PCNA — білок, що служить фактором процесивності ДНК-полімерази-дельта (Pol δ) клітин еукаріотів. Функціонально активний білок утворений трьома однаковими субодиницями, кожна з яких складена з двох ідентичних доменів. Тривимірний білок охоплює молекулу ДНК у вигляді шестикутника, а назовні виступають шість структур, кожна з яких утворена β-листками та має багато сайтів для зв’язку з іншими білками. Підвищення процесивності ДНК-полімерази досягається через оточення молекули ДНК білком, внаслідок чого створюється топологічний зв’язок між ДНК та полімеразою. У відповідь на ушкодження ДНК цей білок убіквітинується і бере участь у RAD6-залежному шляху репарації ДНК [1].

PCNA спочатку був охарактеризований як ковзаюче уздовж ДНК кільце для структурної організації реплікативних ДНК-полімераз і як важливий компонент еукаріотичної хромосомної ДНК-реплісоми. Подальші дослідження, однак, продемонстрували його здатність взаємодіяти з багатьма партнерами, які беруть участь у кількох метаболічних шляхах, включаючи процесинг фрагментів Оказакі, репарацію ДНК, транслезійний синтез ДНК, метилювання ДНК, ремоделювання хроматину і регуляцію клітинного циклу. Отже, PCNA в клітинах ссавців відіграє ключову роль у контролі декількох реакцій за допомогою координації та організації різноманітних партнерів [1–3].

Хоча зовнішня поверхня кільця PCNA взаємодіє з полімеразами та іншими факторами, роль внутрішньої стінки, що звернена до ДНК, є неясною. Останні дані свідчать, що консервативні основні залишки у центральному каналі PCNA створюють специфічну поверхню, яка розпізнає кістяк ДНК і дозволяє кільцю ковзати за допомогою обертального руху вздовж спіралі ДНК. Поверхню ковзання можна модулювати за допомогою ацетилювання лізину, який ініціює деградацію PCNA під час репарації видаленням нуклеотидів (nucleotide excision repair — NER) і стимулює відновлення гомологічною рекомбінацією (HR) або шляхом зв’язування білкового фактора p15^PAF, який вимикає обхід уражень ДНК. Таким чином, внутрішня поверхня PCNA є високорегульованою відносно контролю стійкості до ушкоджень ДНК. Зі структурної точки зору це відкриває нові перспективи щодо функціонування PCNA і можливості розробки інструментів для маніпулювання реакцією на ушкодження ДНК при лікуванні раку [4].

Взаємодіючими з PCNA білками (PIP) у реплікації ДНК, репарації ДНК і контролі клітинного циклу є: Pol δ, Pol ε, RF-C, ДНК-лігаза I, Fen1, Topo I — реплікація і репарація ДНК; Topo IIα, MLH1, MSH 2/3/6 — репарація помилково спарених основ ДНК; XP-G ендонуклеаза — репарація видаленням нуклеотидів; WRN-геліказа — репарація подвійних розривів ланцюга ДНК, пов’язана із синдромом Вернера; UBC9 — сумоїлювання; AP-ендонуклеази APN1, APN2, урацил-ДНК-глікозилаза, Pol β — репарація видаленням основ; Pol ι, Pol κ, Pol λ — транслезійний синтез; Pol η — транслезійний; пов’язаний із захворюванням XP-V; циклін/CDK, p21 — контроль клітинного циклу.

Білки, що взаємодіють із PCNA у метаболізмі хроматину, когезії сестринських хроматид та апоптозі: CAF-1 — епігенетичне спадкування, мобілізація на ушкодження ДНК; P300 — посилення функції PCNA при репарації ДНК; MeCTr — підтримка патерну метилювання; Ctf7p — поєднання когезії сестринських хроматид із реплікацією ДНК; CHL12 — альтернативний клемп-завантажувач при когезії сестринських хроматид; Gadd45, MyD118 — негативний контроль ростових процесів, запобігання апоптозу; Ing1p33ING1 — захист від УФ-індукованого апоптозу [1, 3].

Основні регіони кільця PCNA, що беруть участь у білок-білковій взаємодії: 1) Pol δ, p21, MeCTr, ДНК-лігаза I, Fen1 — міждоменна сполучна петля (амінокислоти від L121 до E132); 2) циклін D — внутрішня сторона α-спіралі на N-кінці; 3) Pol ε, RF-C, CDK2, Gadd45 — С-кінцевий хвіст [1, 3].

Є декілька спеціалізованих метаболічних шляхів для репарації ушкоджень ДНК, включаючи репарацію видаленням нуклеотидів (NER), репарацію видаленням основ (base excision repair — BER), репарацію помилково спарених основ (mismatch repair — MMR) та репарацію подвійних розривів ланцюга (double-strand break repair — DSBR). Все це пов’язано з етапом синтезу ДНК, який потребує Pol δ або Pol ε, що вказує нa функціонування PCNA. Крім того, що PCNA функціонує як допоміжний фактор для полімерази, він відіграє й іншу роль у репараційних процесах. Для безпомилкового толерантного шляху репарації ушкодження ДНК необхідна поліубіквітинізація PCNA. Сумоїлювання PCNA (переважно за Lys-164) мобілізує антирекомбіногенну геліказу Srs2 для інгібування небажаної рекомбінації при синтезі ДНК. Srs2, геліказоподібний фермент, який відриває рекомбіназу Rad51 від хроматину. Цей механізм допомагає реплікації, запобігаючи небажаній рекомбінації між новоутвореними сестринськими хроматидами. Примітно, що Srs2 може безпосередньо зв’язувати PCNA, але завдяки C-кінцевому сумовзаємодіючому домену (SIM) він зв’язує сумоїльовану PCNA з набагато вищою афінністю [5].

Нещодавно було охарактеризовано убіквітин-лігазу E3 — CRL4 Cdt2, яка поєднує протеоліз із синтезом ДНК за допомогою незвичайного механізму, що включає відображення субстратних дегронів на процесивному факторі ДНК-полімерази — PCNA. Завдяки деструкції Cdt1, p21 та Set8, CRL4 Cdt2 проявляє себе як головний регулятор, який перешкоджає ререплікації в S-фазі клітинного циклу [6].

Якщо стикувальний сайт PCNA модифiкується, наприклад, у ракових клiтинах, реплiкацiя ДНК i процес репарацiї можуть змiнюватися. В такому разі з’являється можливiсть для таргетної терапiї деяких типiв раку [7].

У більшості досліджених нами пухлин експресія PCNA у пухлинній тканині перевищує таку в нормальних тканинах [8–10]. У тканинi фолiкулярної карциноми спостерiгався високий рiвень експресiї PCNA, проте рiзниця мiж умовно нормальною та пухлинною тканинами була практично вiдсутня на вiдмiну вiд фолiкулярної аденоми, де кiлькiсть антигена в пухлиннiй тканинi перевищувала його кiлькiсть в умовно нормальнiй тканинi майже в 2,5 раза. Рiвень PCNA у пухлиннiй тканинi папiлярних карцином був вищим, нiж у нормальнiй тканинi. Слiд зазначити, що в iнкапсульованих пухлинах це перевищення становило тiльки 85 %, тодi як у неiнкапсульованих, метастазуючих пухлинах кiлькiсть PCNA була вищою вiд норми в середньому бiльше нiж утричі, а в окремих пухлинах з метастазами в легенi — навiть у 4 рази. В тканинi багатовузлового зоба рiвень експресiї PCNA був низьким (на рівні умовно нормальної тканини більшості пухлин), i рiзницi мiж зміненою та умовно нормальною тканинами виявлено не було [8–10]. Отже, кiлькiсть PCNA у пухлинних тканинах ЩЗ може служити маркером для оцiнки агресивностi пухлин.

Для визначення біомаркерів, корисних для діагностики раку ЩЗ та встановлення панелі маркерів щодо раннього виявлення метастатичних карцином ЩЗ було проведено низку досліджень, які, зокрема, показали, що у метастатичних пухлинах рівень PCNA вище майже удвічі, ніж у неметастатичних [11, 12]. Iншi дослiдники вiдзначали підвищену експресiю PCNA у карциномах ЩЗ порiвняно з аденомами [13]. Найвищий рiвень експресiї PCNA спостерiгався в найагресивніших типах раку ЩЗ — анапластичнiй та медулярнiй карциномах. У диференцiйованих пухлинах кiлькiсть антигена була дещо меншою, але помiтно зростала в iнвазивних варiантах цих пухлин [14]. Експресія PCNA була посилена у B-RAF V600E-позитивних PTC порівняно з B-RAF V600E-негативними [15].

Аналіз виживання хворих, який пов’язували з рівнями маркерів PCNA та Ki-67, показав найкращий прогноз у пацієнтів із низькими показниками PCNA (вижили 72,7 %); гірші результати спостерігались у пацієнтів із середніми показниками PCNA — 51,5 %, а найгірший прогноз характерний для пацієнтів з найвищими показниками антигена (виживання лише 12,5 %) [13]. За оцінки 13 білкових маркерів спостерігались значні відмінності в імунореактивності між карциномою ЩЗ та аденомами ЩЗ для FHIT, p16, PCNA, p53, MMP-7, HBME-1, Е-кадгерину, ММР-2, РТТГ та hTERT. Не було виявлено вірогідних відмінностей для PPAR-γ, Ki-67 або bFGF. У цьому дослідженні в карциномах ЩЗ експресія p53 та PCNA була значно вищою порівняно з аденомами ЩЗ, у той час як експресія Ki-67 не відрізнялася між двома групами [16].

У немеланомних раках шкіри інгібування канцерогенезу супроводжувалося зменшенням експресії PCNA [17].

Мутація p53 (mtp53), яка є онкогенною для молочної залози, також пов’язана зі збільшення експресії PCNA [18].

Рівень експресії PCNA в тканинах раку яєчників був значно вищим, ніж у доброякісних тканинах пухлин яєчників та нормальних тканинах яєчників, а рівні експресії цього показника у тканинах погано і помірно диференційованого раку яєчників були помітно вищі, ніж у тканинах добре диференційованого раку. Експресія PCNA в тканинах раку яєчників з метастазами у лімфатичні вузли була значно вище порівняно з тканинами раку яєчників без метастазування [19].

Зараз проводяться дослiдження з розробки iнгiбiторiв PCNA, якi могли б мати терапевтичний ефект [20]. Так, данi щодо пригнiчення PCNA трийодтиронiном (Т₃) стали основою синтезу невеликого за розмiрами небiлкового та, що важливо, негормонального iнгiбiтора Т2-амiноспирту, похiдного вiд Т₃. Iнгiбiтор зв’язується з РIР-боксом (PCNA-interacting protein box) антигена, перешкоджаючи останньому взаємодiяти з ДНК та ДНК-полiмеразами [21].

PCNA не тільки відіграє важливу роль у регулюванні синтезу та репарації ДНК, але й є незамінним для росту та виживання ракових клітин. Раніше повідомляли про нову асоційовану з раком ізоформу PCNA (caPCNA), яка повсюдно експресується у широкому діапазоні ракових клітин і тканин пухлини, але не в нормальних клітинах [22]. Виявили, що ділянка L126-Y133 caPCNA структурно змінена та доступна для білок-білкової взаємодії. Пептид, який може проникати у клітину і містить послідовність L126-Y133, блокує дію PCNA у ракових клітинах і вибірково вбиває ракові клітини та ксенотрансплантовані пухлини. Були створені невеликі молекули, орієнтовані на цю ділянку пептиду PCNA, як потенційно протиракові агенти широкого спектра. Так, AOH1160 вибірково вбиває багато типів ракових клітин при концентраціях нижче від мікромолярних, не завдаючи значної шкоди нормальним клітинам. AOH1160 перешкоджає реплікації ДНК, блокує гомологічну рекомбінант-опосередковану репарацію ДНК і зумовлює арешт клітинного циклу. Він викликає апоптоз у ракових клітинах та підвищує їх чутливість до цисплатину. Ці результати продемонстрували потенціал інгібітора PCNA — AOH1160 як терапевтичного агента широкого спектра для лікування раку [22].

Є дані, що PCNA регулюється мікроРНК-154-5р [23]. Біоінформаційний аналіз показав, що PCNA-1 є потенційною мішенню мікроРНК-204, яка регулює проліферативні, міграційні та інвазивні можливості ракових клітин легень шляхом взаємодії з PCNA-1 [24].

PCNA експресується на поверхні ракових клітин і діє як інгібуючий ліганд для NK-клітинного рецептора NKp44-ізоформи-1. Одержані моноклональні антитіла проти NKp44-PCNA, які можуть підвищувати NK-клітинну протипухлинну активність як in vitro, так і in vivo [25].

Шляхи PCNA і JNK1-Stat3 відповідно сприяють та інгібують за зворотним зв’язком ампліфікацію центросом шляхом таргетування комплексу ROCK1/14-3-3σ в клітинах раку товстої кишки людини [26]. Також PCNA бере участь у формуванні геномної нестабільності та гіперчутливості до ушкоджень ДНК [27], що є важливим у функціонуванні злоякісних пухлин.

Експресія PCNA, Ki-67 і COX-2 має велике значення у виникненні, інвазії та утворенні метастазів при раку молочної залози. Існує сильна кореляція між рівнями експресії цих факторів і рентгенологічними характеристиками при мамографії у інвазивних раках молочної залози. Застосування Х-променів у мамографії дозволяє оцінити рівні експресії PCNA, Ki-67 і COX-2 в тканинах раку молочної залози і тим самим прогнозувати біологічну поведінку цих ракових клітин [28].

Отже, кiлькiсть PCNA у пухлинних тканинах ЩЗ та інших типах пухлин може служити дiагностичним та прогностичним маркером для оцiнки агресивностi пухлин, а розробка ефективних iнгiбiторiв антигену може бути перспективним напрямом при лiкуваннi раку ЩЗ.

Конфлікт інтересів. Автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів при підготовці даної статті.